内皮抑素低分子肝素修饰及对兔角膜新生血管抑制作用.doc

内皮抑素低分子肝素修饰及对兔角膜新生血管抑制作用 　【摘要】 目的 探讨利用低分子肝素对内皮抑素进行结构修饰，并评价其对角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)的抑制作用。方法 采用化学方法用低分子肝素修饰内皮抑素，碱烧伤法建立兔角膜新生血管模型，分别在球结膜下注射低分子肝素化内皮抑素（Ⅰ组）、内皮抑素（Ⅱ组）和生理盐水（对照组），观察新生血管的生长情况。结果 成功的利用低分子肝素对内皮抑素进行了结构修饰，动物实验表明Ⅰ组新生血管的长度、面积、数量、VEGF的表达均明显低于其它两组，差异有统计学意义（Plt;0.05）。结论 低分子肝素化内皮抑素可有效抑制角膜新生血管的生长，效果优于内皮抑素。 【关键词】 低分子肝素 内皮抑素 修饰 角膜 新生血管 兔 its angiogenesis effects on rabbit corneas Abstract: Objective To investigate the modification of endostatin (ES) with low molecular weight heparin (LMEH) and its inhibitory effects on corneal neovascularization（CNV）. Methods ES was modified with LMWH by a chemical method. The rabbit CNV model was made with alkali burning. LMWHES(group 1)， ES (group 2) and normal saline(control group) were subconjunctivally injected. Results The blood vessel was shorter and smaller in group 1 than in the other two groups(Plt;0.05) and the expression of VEGF in group 1 was also significantly lower than that of the other two groups(Plt;0.05). Conclusions LMWHES can effectively inhibit the growth of CNV and is superior to ES. Key words: Low molecular weight heparin; Endostatin; Modification; Cornea; Neovascularization; Rabbit 找一种效果更佳的内皮抑素修饰物。 1 资料与方法 1.1 材料 含内皮抑素基因的重组表达载体工程菌（山东大学免疫学研究所）； LMWH（50 antFXa u/mg，中国烟台东诚生化有限公司）； 健康成年新西兰白兔30只（山东大学动物实验中心），体重2.0 2.5?kg，雌雄兼有，眼部无异常。 1.2 方法 1.2.1 LMWH对ES的化学修饰 采用毕赤酵母表达系统，按照文献［4］的方法进行内皮抑素蛋白的表达，分离纯化后得到电泳单点纯的内皮抑素。采用高碘酸氧化法活化LMWH，制得LMWH活化液，于pH 9.5、0.3?mol/L的NaCO- NaHCO3缓冲液中对内皮抑素进行化学修饰。通过SDSPAGE电泳监测修饰反应过程，比较不同时间点修饰液的自由氨基修饰率、活性保留百分率。测定ES及LMWHES在25?℃和37?℃水浴中的热稳定性。 1.2.2 LMWHES及ES对兔角膜碱烧伤后新生血管抑制作用的观察 30只兔用氯胺酮（25?mg/kg）及氯丙嗪（25?mg/kg）诱导全麻，将浸润1?min的1?mol/L氢氧化钠滤纸片置于兔右眼角膜中央30?s，然后立即用20?ml BBS冲洗烧伤区及结膜囊1?min建立实验模型。 随机将兔分为3组，每组10只。碱烧伤后第一天，分别在球结膜下注射50?μg/ml LMWHES（Ⅰ组）、50?μg/ml内皮抑素（Ⅱ组）和生理盐水（对照组）各0.2?ml，以后隔日注射1次，共8次。每天行裂隙灯显微镜观察球结膜、角膜有无充血、水肿及全身状况。并于术后第4、7、10、13天用双脚规测量CNV长度，并用数码相机定位拍摄CNV生长状态，将其输入计算机使用软件Image Pro Plus进行图像分析。 碱烧伤后16天用空气栓塞法处死动物，无菌下取带2?mm宽巩膜的角膜组织进行病理学检查 ，进行HE染色和SP免疫组化分析。染色结果判断：细胞浆黄色为+，棕色为，棕黑色为；