丙酮丁醇梭菌遗传作系统的改造.pdf

分类号 密级 UDC 编号 中国科学院研究生院 博士学位论文 丙酮丁醇梭菌遗传操作系统的改造 董红军 指导教师 李寅 研究员 中国科学院微生物研究所 申请学位级别 博士 学科专业名称 微生物学 论文提交日期 论文答辩日期 培养单位 中国科学院微生物研究所 学位授予单位 中国科学院研究生院 答辩委员会主席 A Dissertation Submitted to the Committee of Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences for Ph.D. Degree Improvement of Genetic Manipulation System for Clostridium acetobutylicum By Hongjun Dong Directed by Prof. Yin Li May 2011, Beijing 摘要 摘要 丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)是一种工业上用于生产溶剂(包括丙酮、 丁醇、乙醇)的细菌。由于丁醇是一种潜在的可替代汽油的生物燃料，丙酮丁醇梭菌 近年来引起了广泛的关注。对丙酮丁醇梭菌的遗传学研究及菌株改造是实现其产业化 的一个基础工作，但是由于丙酮丁醇梭菌是严格厌氧的革兰氏阳性细菌，虽然目前已 经发展出一些遗传操作方法，但是仍存在着不少问题，限制了遗传操作的效率。 本论文就目前丙酮丁醇梭菌遗传操作过程中所遇到的一些基本问题进行了研究， 主要包括：1)解除丙酮丁醇梭菌中的限制修饰系统。丙酮丁醇梭菌细胞内存在着严格 的限制修饰系统，可以降解外源DNA，目前的解决方法是对要进行转化的DNA 进行 甲基化修饰(使用来自芽胞杆菌噬菌体Ф3TI 甲基化酶)。本论文选定可能编码二型限制 性内切酶Cac824I 的基因CAC1502 为靶点，通过二型内含子基因敲除技术对其进行了 失活，得到了突变体菌株SMB009 ，使用该菌株进行转化时，使用的DNA 无需预先进 行DNA 甲基化修饰即可实现转化。2)实现丙酮丁醇梭菌的有氧转化。因为丙酮丁醇 梭菌对氧气敏感，所以对其进行操作的过程需要在厌氧条件下(厌氧箱)进行。为了能 够使丙酮丁醇梭菌在空气中进行操作，我们以SMB009 为出发菌株，失活了其中的氧 气响应负调控蛋白编码基因CAC2634，得到的突变体菌株SMB012 可以实现在空气中 进行转化操作，使得整个操作过程可以不依赖于厌氧箱，且节约时间近40% 。3)发展 了适用于丙酮丁醇梭菌的诱导型表达系统。我们以氯霉素抗性基因cat 的启动子为模 型，通过引入不同组合的四环霉素抗性基因操纵子调控序列tetO ，发展出了 pGusA2-2tetO1 和pGusA2-tetO2/1 两个系统，经100 ng/ml 脱水四环霉素(aTc)诱导3 小时后，报告基因表达的β-葡萄糖苷酸酶(GusA)诱导倍数分别是120 倍