α-溴代肉桂醛对酪氨酸酶抑制-厦门大学学报自然科学版.doc

doi: 10.6043/j.issn.0438-0479.201607025 α-溴代肉桂醛酪氨酸酶抑制动力学及杀虫作用的研究 （厦门大学 生命科学学院滨海湿地生态系统教育部重点实验室，福建 厦门 361005 摘要：酪氨酸酶EC 1.14.18.1）是黑色素合成的关键酶染色和酶抑制动力学两种手段检测了α-溴代肉桂醛蘑菇酪氨酸的抑制作用.793 (mmol/L)-1 min-1和1.98×10-3 s-1。在此上了α-溴代肉桂醛棉铃虫的毒杀作用发现0.625 mmol/L α-溴代肉桂醛后，棉铃虫幼虫的生长发育受到程度限制，α-溴代肉桂醛，致死5 mmol/L α-溴代肉桂醛棉铃虫的多酚氧化酶抑制活体和的分别被抑制62.68%和39.21%。α-溴代肉桂醛保鲜、农业、医药等方面 关键词：α-溴代肉桂醛；； 中图分类号：Q 文献码：A 文章编号： 酪氨酸酶EC 1.14.18.1）作为黑色素合成的限速酶，其活性与黑色素的合成量成正相关[1]当其在人体中异常表达能引起雀斑和黑色素沉积等皮肤病。对昆虫而言，酪氨酸酶参与其表皮黑化骨针形成伤口愈合以及对外源病原体的包被吞噬等重要生命活动[2]。此外细菌而言，酪氨酸酶具有举足轻重的作用，酶催化，形成的黑色素能保护细菌的孢子免受紫外线的伤害，还能螯合重金属离子以消除重金属离子对细菌细胞的伤害[3]。酪氨酸酶生理功能酪氨酸酶抑制剂成为国内外研究的热点。肉桂醛已被广泛应用于香精香料、化工生产、食品工程、粮食生产、果蔬保鲜、牲畜饲料等多种领域[4]。近年来，衍生物也在不断被合成和开发[5]报道了邻羟基肉桂醛的衍生物具有抗菌、抗炎、抑制癌细胞增殖等多种活性。[6]发现α-溴代肉桂醛对淡紫拟青霉、黑曲霉和宛氏拟青霉有抑制作用。 收稿日期：2016-7-21 录用日期：2016-11-11 基金项目：国家自然科学基金 *通作者qwang@xmu.edu.cn 我们已研究并报道了肉桂醛衍生物对蘑菇酪氨酸酶的抑制效应，α-溴代肉桂醛对酪氨酸酶具有良好的抑制作用[7]在基础上，α-溴代肉桂醛探α-溴代肉桂醛 1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 供试 供试的棉铃虫（Helicoverpa armigera）及其无菌饲料均来自湖北省生物农药工程研究中心，培养温度控制在（30±2）℃，相对湿度为70%，光周期与自然光周期同步。 1.1.2 试剂 α-溴代肉桂醛产品蘑菇酪氨酸酶L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）为Sigma-Aldrich公司产品酶活力为mg；其他试剂均为国产分析纯试剂；使用的蒸馏水为去离子重蒸水． 1.2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）实验 Native电泳参照[8]方法操作，SDS），除了考马斯亮蓝染色的蘑菇酪氨酸酶样品外，其它样品均不加热。上样酶液中蘑菇酪氨酸酶的活力为1000 U/mL（用50 mmol/L，pH 6.8的磷酸盐缓冲液（PBS）配制），每孔上样量为20 μL。电泳结束后，每一泳道切为一片胶片，并将胶片按原泳道顺序依次浸泡在浓度由低到高的抑制剂溶液中，在摇床上旋转振摇45 min后取出，用10 mg/mL L-DOPA在37 ℃下孵育1 min，进行活性染色。除活性染色操作外，上述过程均在4 ℃下进行。 1.2.2 α-溴代肉桂醛 α-溴代肉桂醛对酪氨酸酶抑制作用动力学根据邹承鲁[9]的酶失活过程中的底物反应动力学方法测定。以0.50 mmol/L的L-DOPA为底物，不同浓度的α-溴代肉桂醛与蘑菇酪氨酸酶（终浓度3.33 μg/mL）反应，监测反应的过程曲线，L-DOPA475 nm处有最强吸光值。在Beckman DU800型分光光度计下测定OD475随时间的增长过程，产物在475 nm处的克分子消光系数按ε=3700（mol/L(cm）-1计算。不同底物浓度下的酶失活动力学，根据合适的作图方法测定酶的失活微观速度常数。固定底物浓度L-DOPA为0.5 mmol/L，改变抑制剂浓度，实时跟踪测定800 s，以时间对产物量作图。固定抑制剂的浓度，改变底物浓度，设定L-DOPA分别为0.50，0.75，1.00，1.50和2.00 mmol/L，实时跟踪测定800 s，以时间对产物作图。 1.2.3 α-溴代肉桂醛对棉铃虫毒力测定 采用平板喂食法[10]。以乙酸乙酯为溶剂，采用倍比稀释法配置出分别为12.5，25，50和100 mmol/L的α-溴代。吸取3 mL的饲料分装于24孔板中，每孔中再加入150 μL不同浓度的α-溴代肉桂醛混于饲料中，使其均匀的分布每孔中α-溴代肉桂醛终浓度为。每个浓度4个孔，平行重复3块板。待乙酸乙酯挥发完全后，用毛笔转移棉铃虫幼虫，每孔1只，每个浓度共计12只虫。每隔24 h拍照观