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熊果酸及齐墩果酸对胰脂肪酶活性及构象影响 　 作者：刘志芳，田萌，马跃文，李政，李黎，刘克武 【摘要】 　　目的研究熊果酸（UA）和齐墩果酸（OA）对胰脂肪酶（LPS）活性和构象的影响。方法采用紫外光谱法、荧光光谱法以及圆二色谱法分析UA和OA作用后LPS相应图谱的特征。结果UA和OA作用后LPS的活性明显降低，紫外吸收光谱发生改变。荧光淬灭结果显示UA作用后，LPS的荧光发生淬灭，且淬灭的机制为静态淬灭和动态淬灭组合的淬灭机制，而OA对LPS荧光淬灭主要为静态淬灭；UA和OA作用后LPS的圆而色谱图谱发生改变。结论UA和OA都可以抑制LPS的活性、影响LPS的构象，且UA对LPS的构象影响及抑制作用更加显著。 【关键词】 熊果酸 齐墩果酸 胰脂肪酶 紫外光谱 荧光光谱 圆二色谱 　　脂肪酶(lipase，简称 LPS) 是一种特殊的酯键水解酶，广泛存在于动物组织、植物种子和微生物体中，它能催化天然底物油脂水解，产生脂肪酸和甘油 ［1］。 　　熊果酸(ursolic acid, UA ) 和齐墩果酸(oleanolic acid, OA )为同分异构体,均属于五环三萜类化合物,广泛存在于中草药中,且具有多种生物活性［2］。OA和UA都具有一定的降脂作用，能够有效地降低高脂血症小鼠的血脂［3，4］，有望开发成新型降脂药。但OA和UA降脂作用的强弱的比较及降脂作用机理尚未见报道。本文采用紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱等方法，研究了UA和OA对LPS活性及构象的影响，比较了UA和OA对LPS抑制作用的强弱，为探寻OA和UA降脂作用机理，将其开发为一种双成分降脂新药提供理论参考。 　　1 仪器与试剂 　　F-4500荧光光谱仪(日立)，TU-1800紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司），JASCO-J-810圆二色谱仪(日本JASCO公司)。齐墩果酸和熊果酸购自陕西森弗生物技术有限公司，胰脂肪酶购自Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。 　　2 方法 　　2.1 UA，OA对LPS活性的影响 　　2.1.1 UA，OA对LPS的抑制作用酶活性测定采用铜皂法［5］。 　　2.1.2 UA，OA对LPS的抑制动力学研究 　　在酶的反应体系中分别加入不同浓度的UA和OA，改变底物橄榄油的浓度，测定酶促反应的初速度。以Lineweaver-Burk双倒数法作图，并计算抑制速度常数。 　　2.2 UA，OA对LPS构象的影响 　　2.2.1 不同浓度UA、OA对LPS的紫外吸收光谱和荧光光谱测定 　　取2 ml浓度为1×10-5 mol/L的LPS溶液，分别加入不同微量体积的UA和OA（1.0×10-3 mol/L）溶液，使三萜类小分子与LPS的终摩尔比分别为0／1，0.2／1，0.4／1，0.6／1，0.8／1，1／1，3／1，5／1。混合均匀后，室温放置10 min，以相同浓度的小分子溶液作空白，记录 200～300 nm的紫外吸收光谱。 　　以295nm为激发波长，室温下测定300～400 nm的荧光光谱，溶液浓度及反应条件同上述。 　　2.2.2 圆二色(CD)谱测定 　　样品池光程为0.1 cm ,在室温下测定波长范围190～250 nm的CD谱。CD谱用平均残基摩尔椭圆度表示，单位为deg ·cm2 ·mol -1 ，数据经3次扫描取平均值。得出CD谱后, 用该仪器附带的杨氏方法软件计算脂肪酶的二级结构含量。LPS浓度为1 ×10-5 mol/L，实验时三萜类小分子与LPS的终摩尔比为0／1，0.4／1，3／1。 　　3 结果与讨论 　　3.1 UA，OA对LPS活性的影响 　　不同浓度的UA，OA对LPS活力的影响结果见图1。由图1可以看出，UA，OA对LPS都有一定的抑制作用，抑制作用随UA，OA浓度的升高而增强。在相同浓度下，UA的抑制作用大于OA。 　　3.2 UA，OA对LPS的抑制 　　动力学UA，OA对LPS的抑制作用如图2。由图可知随着UA，OA浓度的升高，酶的Km值保持不变，而Vmax则随UA，OA浓度的升高而不断降低。因此UA、OA对LPS均属于非竞争性抑制。 　　采用Dixon作图法，以1/V对不同浓度的UA，OA作图，可得到UA，OA的抑制常数Ki。UA，OA的Ki分别为0.6 mmol/L，0.46 mmol/L，可见抑制作用UA大于OA。 　　3.3 不同浓度UA，OA对LPS的紫外吸收差谱 　　大多数蛋白质分子在280 nm附近有一个吸收峰，是由于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等芳杂环对光的吸收；同时在220 nm左右有一个由肽键的C=O的π-π跃迁引起的强吸收峰，与蛋白质的α-螺旋含量有关［7］。 　　用不同浓度的UA，OA作用于LPS的紫外吸收差谱如图3。可知LPS在