以MERS-CoV主蛋白酶为靶点的药物筛选体系的建立及应用-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（１２）：５１５６ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 技术与方法 檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 以ＭＥＲＳＣｏＶ主蛋白酶为靶点的药物 筛选体系的建立及应用 １，３ １，３ ３ ４ ２ ２，３ 张　宁 　潘　丽 牛国君 　王文明 　周红刚 　杨　诚 （１天津科技大学生物工程学院　天津　３００４５７　２南开大学药学院　天津　３００４５７） （３天津市国际生物医药联合研究院有限公司　天津　３００４５７　４南开大学生命科学学院　天津　３００４５７） 摘要　目的：以新型冠状病毒（ＭＥＲＳＣｏＶ）主蛋白酶ＮＳＰ５为靶点，应用荧光共振能量转移法 （ＦＲＥＴ）建立药物筛选体系，并进行抑制剂的筛选。方法：采用原核表达系统、利用基因重组以及 蛋白表达纯化技术得到目的蛋白，ＦＲＥＴ法检测蛋白酶活性，优化反应条件以及确定酶、底物的浓 度，建立药物筛选体系，对７００种化合物进行了检测。结果：应用建立的药物筛选体系，筛选到抑 制率较高的化合物共６种，并测得ＩＣ值，其中ＭＤＣＣＣＬ００２３３０的ＩＣ值最低，为（０．４３±０．０３） ５０ ５０ μｍｏｌ／Ｌ。结论：建立的药物筛选体系较为理想，适用于ＮＳＰ５抑制剂的筛选，促进先导化合物的 研发。 关键词　ＮＳＰ５　抑制剂　高通量筛选　ＭＥＲＳＣｏＶ 中图分类号　Ｑ８１９ 　　２０１２年初，一名沙特男子感染新型冠状病毒死 以单峰驼作为传播中介，传入中东。新的晶体结构揭 ［１］ 示这种新型冠状病毒能以宿主细胞表面二肽基肽酶 亡 。同年９月，一名卡塔尔男子也感染了这种病 ［２］ ＤＰＰ４作为功能受体，通过病毒表面Ｓ蛋白与ＤＰＰ４结 毒 ，之后该病毒相继在中东其他国家及欧洲蔓延，至 ［３］ 合，介导病毒融合，从而激发感染 ［９１０］。 今导致９４人感染，死亡率达到５０％ 。经世界卫生组 织证实，这种新型冠状病毒与 ＳＡＲＳ病毒同属一个家 　　ＭＥＲＳＣｏＶ作为单股正链的ＲＮＡ病毒，基因组可 族。因于２０１２年在中东首次被鉴定出来，将其命名为 作为ｍＲＮＡ直接与核糖体作用表达蛋白。位于其基因 中东呼吸综合征冠状病毒 （ＭｉｄｄｌｅＥａｓｔｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ 组５′末端的基因区包含两个相互重叠的编码区，分别 ［４］ 为复制酶多蛋白ｐｐ１ａ和复制酶多蛋白ｐｐ１ａｂ，这两个 ｓｙｎｄｒｏｍｅｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，ＭＥＲＳＣｏＶ） 。该病毒能够引起 人下呼吸道感染，症状表现与ＳＡＲＳ相似，其病毒基因 酶多蛋白对病毒在人体内的复制和转录起着非常重要 组分析显示与蝙蝠身上发现的冠状病毒ＨＫＵ４、ＨＫＵ５ 的作用，复制酶多蛋白上含有约 １６个左右的功能亚 ［５６］ ［７］ 基，只有当这些功能亚基被病毒编码的蛋白酶切割成 具有很高的同源性 。Ｍｅｍｉｓｈ等 的必威体育精装版研究进展 表明这种冠状病毒与沙特阿拉伯一小种群蝙蝠的核酸 独立的蛋白单元，病毒才能完成正常的转录、复制功 ［１１１２］ 序列相似度为１００％，证实了其来源，并推测可能存在 能，而承担这一水解功能的就是主蛋白酶 ＮＳＰ５ ， ［８］ 因此在药物研发中成为一个重