通明质酸酶.ppt

透明质酸酶 于沅平 一、透明质酸酶及透明质酸 透明质酸酶 是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称。根据全国科学技术名词审定委员会公布的《生物化学名词》将hyaluronic acid 译为透明质酸, 《药学名词》和药品的国家标准则将其称为玻璃酸, 两者为同一种物质, 故透明质酸酶亦称为玻璃酸酶。 （一）根据来源和作用的不同, HAase分为3 类: （1）睾丸型HAase ,主要来源为动物睾丸、颌下腺和倍酶体等， （2）透明质酸内-β-葡萄糖醛酸普酶, 来源为水蚝的唾液腺; （3）细菌 HAase ,又称透明质酸裂解酶, 这是一种碱性糖蛋白, 属内切糖昔酶, 能催化透明质酸及硫酸软骨素A、C的β—乙酞氨基己糖糖营键水解。 （2）根据最适PH值的不同将脊椎动物的 HAase分为中性型和酸性型2类 最适PH 为5 左右者是中性型 HAase，如睾丸、一些微生娜蛇和昆虫毒素所含钾 HAase， 最适PH为3.5—4.0者, 是酸性型 HAase，如正常人血清、尿、肝脏含有的 HAase, 肿瘤组织中的 HAase也是酸性型。 二、HAase的基本性质 不同来源的HAase相对分子质量不同。牛睾丸及精液HAase相对分子质量为6.1×104, 蝎毒的为5.4×104 尖吻蝮蛇的为3.3×104, 细菌的则高达15×104。 蜂毒中HAase的分子结构尚不完全清楚, 但已知其相对分子质量约为（4.2-4.4）×104 ，N端为精氨酸, 分子中含有18个酪氨酸和少量的丙氨酸、苏氨酸, 无游离的琉基, 分子中还含有半乳糖, 果糖和甘露糖。从等电点看, 所有动物毒中的HAase都是碱性的, 这不同于睾丸的HAase酸性蛋白和细菌的HAase中性蛋白。 三、HAase的制备。 由于现在市场上使用的HAase 大多是从哺乳动物皋丸中提取的。现将从羊睾丸中提取HAase 的传统工艺及目前研究的热点--从蛇毒提取HAase的工艺做一简介。 1 、从羊辜丸中制备HAase的传统工艺 （1）提取 新鲜睾丸除去内外副睾, 绞成糜浆,称取400g倒入预先配制的冷醋酸液（水360g, 冰醋酸204ml, 1mol/L 盐酸40mL ) 中, 在-5℃以下提取4h, 吊滤, 得提取液。浆渣作2次提取,提取液量为第1次的1/3。 （2）盐析 在不断搅拌下, 每升提取液加人固体硫酸铵（工业用）210g , 完全溶解后静止1h , 用双层涤纶布袋吊滤过夜, 得清液, 不断搅拌。每升清液再加人固体硫酸铵290g, 完全溶解后静止1h,吊滤过夜, 得潮固体。 (3)精制 将粗品溶于少量水中, 装人透析袋,置人100ml磷酸盐-柠檬酸缓冲液中, 在10℃ 左右透析24h后过滤, 得透析液, 再冰浴冷却, 加入15%磷酸钠（12H2O）0.5mL, 不断搅拌下缓缓加入20%醋酸钙溶液0.3mL , 并用氢氧化钠液调pH至8.5, 抽滤, 滤液用盐酸调pH至7.0, 冷冻干燥,得无热原HAase精品。 2、从蛇毒中制备取HAase的工艺 有人用凝胶过滤法从尖吻蛇毒中纯化出透明质酸酶, 并用SDS法测得其相对分子质量为3.3×104。以尖吻蝮蛇蛇毒为原料,在4℃ 左右的低温下纯化得到HAase。 步骤 （1）CM-Sephadex C-50 阳离子交换层析。 （2）Sephadex C-75分子筛层析。 （3）CM-Sephadex C-25阳离子交换层析。用SDS法测得其相对分子质量为3.3×104, 等点聚焦测得等电点为10.3,并通过糖染色法证明HAase是糖蛋白。 四、HAase的应用 1、麻醉辅助剂 ISTA制药公司于2004年12月3日宣布, 美国FDA 已批准其单剂量小包装注射用绵羊透明质酸酶无菌液作为分散剂, 可用于促进其它药物分散和吸收。本品在眼科手术时常与局部麻醉药合用。 2、促使皮下注射液迅速扩散 HAase通过对黏多糖HA的解聚作用, 能加速物质的扩散和吸收, 促使皮下注射液或局部积贮的渗出液、血液等的扩散和吸收, 是一种重要的药物扩散剂, 还有消除血肿和水肿的作用, 与其他注射液，如生理盐水、抗生素、肾上腺素等合用, 可促使皮下注射液迅速吸收。 3、用于肿瘤检测 目前对分离的肿瘤细胞和肿瘤间质细胞检测表明, 肿瘤间质细胞只分泌HA, 肿瘤细胞则能同时分泌HA和HAase, 并且随肿瘤细胞侵袭性的增强而增强。此外, HA和HAase在恶性肿瘤患者的体液(血清、腹水)和排泄物(唾液、尿液) 中明显升高, 经统计学分析具有很高的灵敏性和特异性, 可作为理想的肿瘤标记物。 4、可促扩散、化疾消肿以及治疗肠粘连及青光眼 治疗青光眼使用HAase能加速和促进液体穿通组