脓汁和粪便标本中原菌的检测-4.ppt

医学微生物学实验综合性实验一 脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四） 斜面培养物的观察 革兰染色法 肉汤接种法 显微镜油镜的使用 斜面培养物的观察 从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。 从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明或半透明。 为了讲解方便，以后的实验，仍然沿用初次分离得到菌落的颜色—紫黑或粉红。 从斜面上取菌时，一般只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在培养基表面轻刮一下即可。 革兰染色法原理的三种学说 通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫—碘复合物容易被酒精脱出。 等电学说：G+菌等电点(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般染色时染液的酸碱度在pH7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。 化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料—媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。 革兰染色方法步骤 涂片 → 干燥 → 固定→ ↓ 结晶紫 → 初染1分钟→水洗→ ↓ 卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→ ↓ 95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗→ ↓ 稀释复红→复染1分钟→水洗→ ↓ 吸干,镜检。 ★取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。 ★影响革兰染色的关键步骤是涂片和脱色。 生物安全警告 本次实验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。 气溶胶粒径＞100um沉降很快,＜50um在0.4s内扩散开,＜5um通过呼吸道直接到达肺泡。 Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。 实验时应坐着，在火焰周围10～20厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。 显微镜油镜的使用P13 10×物镜→看清楚标本→滴加香柏油→100×油镜→浸泡油中（几乎与标本接触，工作距离0.13mm）→模糊物象→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源。 将聚光镜调到最高处；孔径光阑环上刻有的物镜倍率（10×，100×）必须转到正面，与使用的物镜相对应。 油镜处理：擦镜纸拭去香柏油 →擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。 显微镜罩上防尘罩→ 横放在实验柜内。 ★(顺德校区）实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。 ★（校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。 温馨提示 因染色场地受限，1～5组先涂片染色，后接种肉汤。6～10组先接种肉汤，后涂片染色。 待染色和肉汤接种完毕，桌面收拾干净，才可镜检，以免污染。 镜检过的载玻片不必擦拭，直接投入玻片缸内消毒、灭菌。 思考题 革兰染色法的关键步骤是什么?为什么? 染色时为什么通常要用新鲜的细菌培养物? 如何使用油镜? * * 斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支， 镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张。 器材准备 染色瓶6组，染色架8个。 细菌染色法 单染色法：只用一种染料染色，能清楚观察菌体大小、形态与排列，不能鉴别细菌。 复染色法（鉴别染色）：采用两种以上的不同染料进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别细菌。 抗酸染色:用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸性细菌，阳性者为红色。 特殊染色：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，极体染色（用于白喉杆菌异染颗粒染色）。 结核分枝杆菌 抗酸染色 麻风分枝杆菌 抗酸染色 产气荚膜梭菌荚膜 Hiss 染色 破伤风梭菌芽胞 芽胞染色 变形杆菌鞭毛 Leifson染色 白喉棒状杆菌异染颗粒 Albert染色 革兰染色法 Gram Staining 革兰染色法是丹麦内科医生 Christain Gram于1884年创立的一种细菌染色方法，已有120多年的历史，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法。 革兰染色的意义 鉴别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。 选择抗菌药物：G+球菌对青霉素敏感,G-杆菌耐药。 了解细菌的致病机理：G+菌大多产生外毒素,G-菌产生内毒素。 革兰染色的步骤 涂片 → 干燥 → 固定→ 染色 接种环取生理盐