转染注意事项经验之谈有血清时的转染血清一度曾被认为会降低转.doc

转染注意有血清时的转染 血清一度曾被认为会降低转染效率，但只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。转染过程在两步中需要使用培养基做为稀释液：在DNA-阳离子脂质体复合物准备过程以及复合物同细胞接触过程。在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。但在复合物形成后，在加入细胞中前可以加入血清。阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEMⅠ培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。 培养基中的抗生素 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。 细胞维护和培养的演变 可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。每周传代一到两次，稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。不要使细胞保持融合超过24小时。 大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率（图13）。融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。或者，几种来源于经筛选，转染效率较高细胞亚系的细胞系现在有售。 细胞铺板密度 用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2×106-4×106细胞/ml时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。在三种不同密度进行细胞铺板的比较表明铺板密度最高的，CAT活性也最高（图14）。得到最高活性所需的LIPOFECTAMINE试剂的量也相应增加了。这些结果说明，对于转染相同量的DNA所需的最佳阳离子脂质体试剂的量会因细胞密度而异。 启动子的选择 获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。同其他启动子，如SV40和RSV（劳斯肉瘤病毒）相比，在BHK-21中其活性最高（图15）。这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子，而单PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白细胞）中的CMV启动子。SV40启动子的表达在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。 DNA量 高质量的DNA对于进行高效的转染至关重要。以前研究者使用CsCl梯度离心得到的DNA进行转染，但是这种方法费时费力。其他的质粒纯化技术如Marligen的High Purity Plasmid Purification System使用独特的阴离子交换树脂纯化DNA，可以得到用于转染的高质量DNA（图16）。另外，Marligen的纯化系统实验步骤很简单，可以在2小时内完成。 瞬时和稳定表达 DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到。仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。几天内，大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。瞬时表达分析检测未重组质粒DNA上基因的表达。因此，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，实验必须很小心。为了进行稳定表达，转入的基因必须能和细胞同步复制。在转染的质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此。在一小部分转