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真菌分生孢子抑制定量聚合酶链反应分析 发布日期：2008年1月4日 ???来源：本刊杂志 编译：袭莎??????? James J. McDevitt ，Peter S. J. Lees1，William G. Merz，Kellogg J. Schwab1摘要：定量聚合酶链反应（qPCR）环境样品分析受到在环境中抽样选中样本中存在的抑制剂的干扰。与室内空气取样相关的抑制剂效果受控测定和内部检测抑制质控标准的能力是通过过滤器收集空气样本进行的，然后通过过滤器强化绿色荧光蛋白质符号的烟曲霉分生孢子。微观分生孢子计数与qPCR结果相比较，与各级颗粒物质和有生存能力在空气中传播的微生物相关。我们的数据显示出PCR可被低至50lg的颗粒物质介质抑制，抑制剂的数量与微粒介子质量（r=0.75）及非丝状微生物的数量（r=0.73）具有必然联系。内部标准DNA的使用确认抑制剂的存在，并表示需要额外的处理样本或样本结论的限定。关键词：空气真菌、烟曲霉、分生孢子、定量聚合酶链反应、颗粒物质、样本抑制 引言??? ??? 与真菌接触的主要途径是通过吸入在空气中传播具有生存性和无生存性的真菌粒子。某些具有生存性的真菌粒子具有引起侵入性感染、引起过敏性疾病、引起毒性作用的能力，并产生挥发性有机化合物(Burge，Pierson，Groves，Strawn，Mishra 2000)。照射评估专业人员经常面临艰巨的任务，在环境样本中可迅速探测到的生物数量很少，例如真菌。评估在空气中传播的真菌很难，因为不具有公认的取样标准议定书或接触准则。从历史上看，空气样本直接通过收集孢子微观检测进行分析，或者更为常见的是在适合的生长环境中在适当的培养基上收集生长的具有生存性的孢子(Burge等 2000；Griffiths，DeCosemo 1994)。防止使用这些传统技术的主要局限性包括样本大小和时间限制，独立微生物的不准确表征，收集介体的超载，过长的分析时间(McDevitt，Lees，Merz，Schwab 2005)。最近工业卫生从业者已开始评估克服传统分析方式局限性的分子检测方式的效用。尤其PCR已表现出极大的成功希望。在过去十年中，定量PCR（qPCR）已开始代替PCR。前者分子技术的主要优势在于其具有列举靶模板的功能，因而比简单的定性是/否结论可提供更多的信息。潜在致病真菌的定量测定中qPCR的功效，比如烟曲霉，已被证明并提出报告(Costa等2001；Haugland，Vesper，Wymer 1999；McDevitt，Lees，Merz，Schwab 2004，2005；Roe，Haugland，Vesper，Wymer 2001；Spiess等2003；Zhou，Whong，Ong，Chen 2000)。烟曲霉和其他真菌分生孢子DNA的qPCR分析是敏感的、具体的，超过许多数量级具有定量线性特性曲线（当这些数据由指数反应转化时），在几个小时内能够提供结论(Costa等2001；Cruz-Perez，Buttner，Stetzenbach 2001；McDevitt等2004，2005)。作为qPCR分析一部分的TaqMan探针的使用促进PCR连续检测扩增曲线，通过测量信号产生，在聚合酶延伸期间荧光标记探针靶核酸序列被分成若干部分(Livak，Flood，Marmaro，Giusti，Deetz 1995)。荧光探针在探针的两端5’和3’包括独立的特定荧石和相应的荧石骤冷。通过Taq聚合酶探针的分裂从骤冷中释放荧石，以允许荧石可被探测器检测。PCR荧光信号的相对周期是由在基线以上的指定阈值（检测阈值）转化而来被称为阈值周期（Ct）。靶模板的最初数值越大，扩增周期所需的超出阈值越小。在Ct和最初靶模板数值log10之间存在线性（负斜率）关系。因此，低Ct与高原始复制数值相关，高Ct数值与低原始复制数值相关。未知样本的Ct确定可与已知数量模板核酸确定的Ct数值构建的标准曲线相关。??? 在环境样本分析中使用qPCR遇到的主要局限性为外因物质的存在，其被称为抑制物，在环境样本中经常可以发现。这些抑制剂干扰PCR扩增反应与Ct起始值，这些并没有在样本的真实靶值浓度中显示出来(McDevitt等2004；Wilson 1997)。由于核酸的PCR分析，抑制剂的问题在很多研究领域已成公认的事实(Alvarez，Buttner，Stetzenbach 1995；Wilson 1997)。抑制剂可引起PCR反应全部或部分失败。当存在的核酸未被发现时，未被发现的完全抑制可能产生假阴性结果，由于PCR信号的减弱部分抑制可能引起核酸浓度的降低（例如Ct值的增加）。抑制剂可能有很多来源，以多种方式干扰PCR反应，复杂的相互作用使抑制的鉴定成为问题。样本