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第五章 分子发光分析法 分子发光：分子吸收一定能量跃迁到较高的电子激发态后，在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光，以此建立起来的分析方法称为分子发光分析法。 分子发光包括荧光、磷光、化学发光等。 一、分子荧光及磷光光谱的产生 电子激发态分子：物质分子吸收入射光子的能量后，价电子从较低能级跃迁到较高能级，这时分子被激发而处于激发态，称为电子激发态分子。 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射； 激发态→基态：多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 电子激发态的多重性 激发态→基态的能量传递途径 b.荧光发射光谱(或磷光发射光谱) c.激发光谱与发射光谱的关系 1.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 1、产生荧光的物质条件 第二节 荧光和磷光分析仪器 日立 F－2500型分子荧光仪 一、荧光分析仪器 紫外-可见分光光度计测量池(吸收池) 第三节 荧光光谱分析方法 荧光强度If正比于吸收的光强度Ia与荧光量子产率? If = ? Ia 据Beer定律： Ia = I0 - It = I0(1- e -? l C) 代入上式得： If = ? I0(1- 10 -? l c) = ? I0(1- e -2.3? l c) 整理得： If =2.3 ? I0 ?lc 在一定条件下： If = K c 荧光强度与荧光物质的浓度成之正比 （但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当?lc?0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系） 一、荧光猝灭 二、温度对荧光强度的影响 　荧光强度对温度影响敏感，因些在分析时要控制好温度。温度增加，荧光强度下降（因为使激发态分子的振动弛豫和内转化作用增加), 因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。在低温下荧光强度有明显增强，故为提高灵敏度，可采用低温测定。 除温度外，介质黏度对荧光强度也有影响。 介质黏度增加也有利于提高荧光或磷光的强度。 三、溶剂 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；溶剂极性增强使物质的荧光波长红移，荧光强度大。 四、溶液pH 具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变，需严格控制溶液pH。 磷光分析 二、磷光的测定方法 1、低温磷光分析 由于激发三重态的寿命长，激发态分子与周围的溶剂分子间发生碰撞和能量转移过程的几率增大，使磷光强度减弱甚至消失，通常在低温下测量磷光 低温磷光分析中，液氮是最常用的合适的冷却剂。溶剂在液氮温度（77K）下应具有足够的粘度，对所分析的试样应具有良好的溶解特性。最常用的溶剂是EPA，它由乙醇、异戊烷和二乙醚按体积比为2：5：5混合而成。 2、室温磷光 由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择的限制等因素，从而发展了多种室温磷光法（RTP）。 （1）固体基质室温磷光法（SS-RTP） （2）胶束增稳的溶液室温磷光法（MS-RTP） （3）敏化室温磷光分析（S-RTP) 第五节 化学发光分析 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法。 一、基本原理 三、 化学发光的测量仪器 四、化学发光的特点 练习 试比较分子荧光与化学发光。 产生分子荧光与磷光的区别。 简述分子荧光与分子结构的关系。 为什么荧光分析法比紫外可见法具有更高的灵敏度和选择性？ 2. 氧的猝灭作用 氧分子是荧光、磷光的猝灭剂， 3. 自猝灭与自吸收 当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自猝灭(浓度熄灭) 自吸收： 没有除氧，溶液中难以观察到磷光 由于?F 1，使荧光强度减弱或消失. 形成二聚体： 由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。 五、 内滤光作用和自吸收现象 若试液中存在能吸收激发光或荧光物质所发射的光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用”。而当荧光物质溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，从而使荧光强度下降，称为“自吸收”。 六、 散射光和Raman光 在荧光分析中，荧光物质分子受激发后产生荧光时，样品溶剂分子也会吸收能量，产生散射光和拉曼光。可采用选择合适的测定波长、选择高分辨仪器，使用干扰小的溶液进行校正等方法消除干扰。 七、荧光污染