6.高效液相色谱法.ppt

高效液相色谱法 学习目标 1.掌握高效液相色谱仪的基本结构、功能和特点； 2.了解高效液相色谱法的分类及应用。 引言：HPLC与经典LC的比较 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。 引言：HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，只占有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，占有机物总数的80%； 流动相的选择：GC采用的流动相中为“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争 操作温度：GC需高温；HPLC常室温进行 主要内容 §6-1 高效液相色谱仪 §6-2 高效液相色谱的类型 §6-1 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统四个主要部分组成。 一、高压输液系统 （一）储液瓶 用于存放流动相。储液瓶材料要耐腐蚀，常用的材料为玻璃、不锈钢、或表面喷涂聚四氟乙烯的不锈钢等； 储液瓶应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内； （二）脱气装置 脱气的目的是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检测。 脱气方式有吹氦脱气、超声波脱气、真空脱气等。 （三）高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪的重要组成部分，提供流动相和样品通过色谱柱、进入检测器所需的动力，其性能好坏直接影响分析结果的可靠性。 高压输液泵应流量稳定，以保证重复测定结果的重复性和定量定性分析的精度； 输出压力高，流量范围宽；耐酸、碱、缓冲液腐蚀；压力波动小；死体积小。 按排液性质可分为恒压泵（如气动放大泵）和恒流泵（如往复柱塞泵）； 气动放大泵结构示意图 特点：制备容易，输液时压力稳定无脉动。但是流量调节不方便，在柱系统流路阻力发生变化时，流量也随之改变。这种泵很少用于梯度洗脱 往复式柱塞泵结构示意图 目前HPLC中使用最为广泛（示意动画） 特点：流量不受柱阻等因素影响，易于调节控制流量；液缸容积小，便于清洗和更换流动相等。 往复式柱塞泵工作原理动画示意图 （四）梯度洗脱装置 梯度洗脱是在同一个分析周期内，利用两种或两种以上的溶剂，按照一定时间程序连续或阶段地改变配比浓度，以改变流动相极性、离子强度或pH值等 梯度洗脱可以改善峰形、缩短分析时间、提高分离度等，其缺点是易引起基线漂移和重现性降低 梯度洗脱分为高压梯度洗脱（内梯度洗脱）和低压梯度洗脱（外梯度洗脱） 二、进样系统 要求：密封性好、死体积小、重复性好、进样时对色谱系统的压力和流量影响小、便于自动化 有进样阀和自动进样装置两种 常见的：如六通阀 坐标式自动进样装置结构 1-坐标式贮样架；2-样品瓶；3-取样针； 4-取样升降机；5-方式切换阀；6-吸样泵； 7-取样针插入口 三、分离系统 色谱柱是高效液相色谱仪的重要部件，由柱管和固定相组成 按主要用途可分为分析型色谱柱和制备型色谱柱 ； 三、分离系统 色谱柱的装填对柱效影响很大，常用匀浆法填充。 为防柱内的填料流出，在色谱柱的两端有烧结不锈钢或多孔聚四氟乙烯过滤片。 装填好的色谱柱或购进的色谱柱，均应检查柱效，以评价色谱柱的质量。 四、检测系统 高效液相色谱仪中的检测器是通过将组分的量转变成为电信号； 检测器应具备灵敏度高、响应对流动相流量及温度变化都不敏感、死体积小、线性范围宽、适用范围广、重现性好的特点。 四、检测系统 常用的检测器有 紫外吸收检测器（UVD） 蒸发光散射检测器（ELSD） 示差折光检测器（RID） 荧光检测器（FLD） 电导检测器（ECD） 质谱检测器（MSD） 紫外吸收检测器（UVD） 紫外检测器是使用最广泛的一种检测器 特点：灵敏度较高，噪声低，检出限小，适合大多数药物的质量分析； 为浓度型检测器；选择性检测器，仅对有紫外吸收的物质有响应； 可用于制备，或与其它检测器串联使用； 对温度和流动相流量波动不敏感，可用于梯度洗脱 。 紫外吸收检测器（UVD） UVD有三种类型：固定波长型、可变波长型及二极管阵列检测器。 目前使用最多的是可变波长型及二极管阵列检测器。 可变波长型紫外检测器 可变波长型紫外检测器是目前高效液相色谱仪中配置最多的检测器，采用氘灯作光源，波