6高效液相色谱1.ppt

第四章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 一、概述 20世纪60年代末70年代初 理论：气相色谱的理论 技术：高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器 因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 优点：高速、 高效、 高灵敏度、 高自动化。 2．高效液相色谱法与气相色谱法 ①分析对象。 ②流动相。 ③ 温度。 二、 高效液相色谱仪 主要结构： 高压输液系统， 进样系统， 分离系统 检测系统。 辅助装置： 如梯度淋洗， 自动进样 数据处理等。 1．高压输液系统 部件组成： 储液罐， 高压输液泵（核心）， 过滤器， 压力脉动阻尼器 ⑴储液罐 化学惰性 低压脱气法 吹氦脱气法 超声波脱气法 ⑵高压输液泵 、①要求： 流量稳定，无脉动 输出压力高 流量范围宽 耐酸，碱缓冲液腐蚀 泵体易于清洗：具有梯度洗脱功能， ②高压输液泵的分类 液压隔膜泵 气动放大泵 注射泵 往复柱塞泵 A、液压隔膜泵 B、气动放大泵 C、注射泵 D、往复柱塞泵 往复泵的优点： 液缸容积小，易于情况，更换系统，特别适合于梯度淋洗，广泛应用于HPLC，但：有脉动， D、往复柱塞泵 克服脉动办法： ①采用多头泵交替联动 ②压力脉动阻滞器 ③改进驱动凸轮的几何形状 WATERS泵的特点、泵体、脉动阻滞器、驱动凸轮。 ⑶梯度洗脱装量 梯度洗脱，又称：溶剂程序 分类：1：低压样度洗脱装置 2：高压梯度洗脱装置 2．进样系统 高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 以克服柱外展宽（又称柱外效应）较突出 。 注射器、进样阀 3 分离系统——色谱柱 色谱柱:柱管与固定相两部分。 柱管材料:玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。故金属管用得较多。 柱长5～30cm， 内径为4～5mm（4.6mm,5mm），凝胶色谱柱内径3～12mm， 预柱。 粒度（＜20μm） 填充法:匀浆填充法， 4．检测系统 有两种基本类型的检测器。 一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下: （l）紫外检测器 最常用：80%的化合物有紫外吸收 应用最早，最广 灵敏度高 对环境温度及流速波动不敏感 可适用于梯度洗脱 原理：比尔定律 A、紫外检测器的分类与特点 单波长式 多波长式 紫外/可见分光式 光电二极管阵列快速扫描式 a单波长紫外检测器 1如紫外—254检测器 光源： 低压录灯 254nm 80~85% 检测池：样品池小于10ul 光路长：10mm 参比池：空气 光电接收元件：光电倍增管 光电管 光敏电阻 b多波长紫外检测器 光路：与单波长紫外吸收检测器一致， 但：光源是氘灯或氢灯 波长：200~400nm， 灵敏度：比254nm紫外检测器要低。 c紫外—可见分光式检测器 是装有流通池的紫外—可见分光光度计， 光源：氘灯和钨灯 d扫描型可变波长紫外检测器 在色谱流停止工作的情况下，记录样品池中洗脱组分的吸收行为， 既可提供色谱图，又可提供光谱图；既可定量，又可定性分析。 但，中断色谱信息，不方便。 e光电二极管陈列紫外检测器 DAD 1976年开始报道 可获得“在流”色谱的全部光谱信息， 即不必停留。可能随色谱峰扫描。 与其他快速扫描检测器相比：