8.1-2 凝胶色谱与离子交换色谱.ppt

* * 在洗脱过程中，所有组分一般都可被洗脱下来，所以装好柱后，可反复使用，无需特殊的再生处理。但多次使用后，凝胶颗粒可能逐渐沉积压紧，流速变慢。这时只需将凝胶自柱内倒出，重新填装。或使用反冲法，使凝胶松散冲起，然后自然沉降，形成新的柱床，这样流速会有所改善。 * 琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应在湿态保存。一般悬浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。百分数表示干胶量。葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物，能被微生物（如细菌和霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝胶本身不被微生物作用，但微生物还是能在此凝胶液中和凝胶床上生长，这样会破坏凝胶的特性，影响分离效果。为防止细菌生长和发酵，可用0.02％叠氮化钠、0.05%三氯叔丁醇（仅在弱酸有效，也适用于其他离子交换剂）或0.002％洗必泰、0.01％醋酸苯汞（在弱碱中有效，也适用于其他阴离子交换剂）以及0.1mol／L氢氧化钠溶液等作防腐剂。层析前再用水或平衡液将防腐剂洗去。 再用乙醚洗去乙醇，干燥(或60～80℃烘干）后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。 * 按操作技术4的方法，将1mL标准蛋白质混合液上柱，然后用0.025mol／L氯化钾-0.2mol／L乙酸溶液洗脱。流速3mL／10min，3mL／管。用核酸蛋白质检测仪280nm处检测，用部分收集器收集，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计于280nm处测定每管光吸收值。 以管号(或洗脱体积)为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。 根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积(Ve) ，以蛋白质分子量的对数1gMr，为纵坐标，Ve为横坐标，作出标准曲线。 根据已测出的Vo和Vi以及Vt，分别求出Kd和Kav * 注意：浓缩严格上说来并非体积排阻色谱的应用。而只是凝胶过滤介质的一个附属用途之一 * 吸附阶段应选择允许目的分子与介质结构达到最高的离子强度。 而洗脱时要选择可使目的分子与介质解吸的最低离子强度。 这就定出了洗脱液离子强度的梯度起止范围。在介质再生之前往往还需用第三种离子强度更高的缓冲液流洗柱床以彻底消除可能残留的牢固吸附杂质。在大部分情况下，吸附阶段溶液盐浓度至少应在10mmol/L以上。 五、流动相的选择依据 * 六、操作方法 1. 离子交换剂的处理 2. 装柱及上样 装柱主要是防止出现气泡和分层，装填要均匀。防止产生气泡和分层的方法是装柱时柱内先保持一定高度的起始洗脱液(一般为柱高的1/3)，加入树脂时使树脂借水的浮力慢慢自然沉降。装柱完毕后，用水或缓冲液平衡到所需的条件，如特定的pH、离子强度等。 * 上 样 加压法是采用打气入柱的方式进行加压，可用一个装有样品的分液漏斗与柱用橡皮塞连接，分液漏斗上端串有压力剂并经缓冲瓶与打气管相连，当达到所需压力时就将打气管夹紧。 减压法是在柱的排出口增设抽气装置，工业上多采用此法。 * 3. 洗 脱 分离不同的物质选用不同的洗脱剂。原则是用一种更活泼的离子把交换在树脂上的物质再交换出来。常用的洗脱剂为酸类、碱类或盐类溶液，改变整个系统的酸碱度和离子强度，以使交换物质的交换性能发生变化，己交换上的物质就逐渐被洗脱下来。为了提高分辨率，常采用梯度洗脱法。 * * 是以化学惰性的多孔性物质作固定相，溶质分子不是与固定相发生相互作用，而是受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。 * * * * Kd越大，越容易向凝胶内部扩散 * 30kD。 * 某些市售的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G系列），使用前要用水溶液进行溶胀处理，软凝胶粒径较大，一般为50 ~ 150?m，硬凝胶粒径较 小，一般为5 ~ 50 ?m。Sepharose 和Sephadex凝胶粒径分 布为45 ~ 165 ?m，而Superose 和TSK Toyopearl HW系列 可小到20 ~ 40 ?m，甚至6 ~ 10 ?m。 * 该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚合而成。只要控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号的凝胶。 而其中交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为交联度，以（C）表示，交联度越大，网孔越小，交联度越小，则网孔越大。 * 一般只在pH2～11的范围内使用 * 从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。 * 从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。 * 交联葡聚糖的基