9 生物分析.ppt

* * * * 因此，在这两项技术的基础上，人们又发明了DNA自动测序法 * * 任何发明都有其必然性，也有其偶然性。在PCR发明前，。。。在一切条件都具备的情况下， 1987年，在为美国西特斯公司工作的穆里斯。。。这样的结局令很多分子生物学家遗憾，对他们来说，这是非常简单的事情，他们却失之交臂。 * * * * Taqman 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 Taqman 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 * MTT法是检测细胞存活和生长的方法。 * 微管和微丝是细胞骨架的重要组成部分，在有丝分裂时，微管解聚并重新聚合成纺锤体。如右图所示，正常的纺锤体应该是对称的两极，染色体排列在中间。 Hoechst33285染色 TUNEL染色 4. Annexin V/PI 荧光双染 细胞凋亡早期膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)会从细胞膜的内侧翻转到外侧，暴露到细胞外环境中。而annexin V是一种Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，对PS有高度的亲和性，因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。 PS转移到细胞膜外不是凋亡所独有的，也可以发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别在于，凋亡的早期细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被碘化丙啶(PI)着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会被PI着染。 因此，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的annexinⅤ和PI结合的双染法，可分辩细胞早期凋亡、晚期凋亡和坏死。 原理： I: Annexin V II: PI I和II叠加 无荧光细胞为正常细胞； 仅有绿色荧光为早期凋亡细胞； 绿色和红色荧光均有为晚期凋亡或坏死细胞。 (二)流式细胞仪(Flow Cytometry)分析细胞凋亡比例 1.碘化丙啶(PI)染色分析 细胞经药物作用一定时间后，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗2次，离心去除PBS，加入预冰冷的70％的乙醇，在-20℃下固定过夜。固定后的细胞用PBS洗2次，加入10?g/mL PI和100?g/mL无DNase的RNase，4℃避光染色半小时，用流式细胞仪测定PI的红色荧光强度。细胞凋亡时，因DNA断裂和细胞核固缩导致PI染色荧光降低，在流式细胞分析中形成亚二倍体峰，亚二倍体峰所占比例即为凋亡细胞比例。 Control 7.00% 49.05% 50?mol/L Triol PI染色、流式细胞仪定量分析Triol对钙化VSMCs凋亡的影响。亚二倍体峰所占比例(M1)即为凋亡细胞百分比。 9.96% 5.59% 15?M Triol 21.80% 11.94% 25?M Triol Control 2.12% 3.75% 绿色荧光强度 红色荧光强度 流式细胞仪分析骨髓基质细胞凋亡过程中的FITC-AnnexinⅤ和PI染色 2. FITC-AnnexinⅤ和PI染色分析 原理：细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶将核小体间的连接DNA降解，形成长度为180～200bp整数倍的寡聚核苷酸片断，在DNA琼脂糖凝胶电泳时呈现特征性“梯状条带(ladder)”。而细胞坏死时DNA随意断裂为长度不一的片断，琼脂糖凝胶电泳呈“弥散状”。 (三)DNA电泳法分析细胞凋亡 细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图 1．细胞色素c诱导0 h 2．细胞色素c诱导1 h 3．细胞色素c诱导2 h 4．细胞色素c诱导3 h 5．细胞色素c诱导4 h 6．阴性对照 7．Marker （ 自赵允、翟中和） Confocal技术的应用 一、原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 在细胞原位检测核酸 在细胞原位检测蛋白质和抗原等 检测细胞凋亡 观察细胞骨架 细胞器观察及检测 检测细胞间隙连接通讯 …… (一)细胞原位检测蛋白质和抗原等 1.免疫荧光标记蛋白质、抗原 荧光探针：FITC是检测细胞总蛋白最常用的荧光探针，同时它又能广泛的标记各种特异性的配体，如用FITC标记的抗体可检测细胞表面抗原，而用FITC标记的激素、生长因子和神经递质可准确的检测细胞相应的特定受体。FITC经488nm激发光激发后发出绿色荧光。 标记方法： 直接法：直接用荧光探针标记的抗体与组织或细胞中相应蛋