Bcl2蛋白在体外阿尔茨海默病样神经细胞退化中保护作用.doc

Bcl2蛋白在体外阿尔茨海默病样神经细胞退化中保护作用 　【摘要】 目的 在体外水平探讨抗凋亡蛋白Bcl2在蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸所诱导的阿尔茨海默病(AD)样神经细胞损伤中是否具有保护作用。方法 以人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y作为体外神经细胞研究材料，用G418筛选稳定转染重组质粒PcDNA3bcl2的细胞克隆，以Western印迹鉴定外源性Bcl2蛋白的表达，MTT还原法检测细胞活力，DNA荧光染料染色法检测细胞凋亡率。结果 G418筛选出重组质粒PcDNA3bcl2和空质粒PcDNA3稳定转染的细胞克隆，前者高表达Bcl2蛋白，而后者不表达该蛋白;用250 nmol/L经典促凋亡剂星形孢菌素分别处理稳定转染PcDNA3bcl2和PcDNA3的细胞24 h，前者的细胞活力(92.5%±8.6%)显著高于后者(65.1%±7.2%)(Plt;0.01),前者的细胞凋亡率(10.0%±1.5%)显著低于后者(38.1%±4.7%)(Plt;0.01);用80 nmol/L冈田酸分别处理稳定转染PcDNA3bcl2和PcDNA3的细胞24 h，前者的细胞活力(78.7%±6.4%)显著高于后者(59.2%±5.1%)(Plt;0.05), 前者的细胞凋亡率(27.2%±3.0%)显著低于后者(46.6%±5.2%)(Plt;0.05)。结论 体外神经细胞中外源性高表达的Bcl2蛋白能显著抑制冈田酸所致细胞损伤，在AD样神经细胞损伤中有保护作用。 【关键词】 Bcl2蛋白;阿尔茨海默病;神经细胞;蛋白磷酸酶抑制剂;转染 tau蛋白过度磷酸化是阿尔茨海默病(AD)中神经细胞退化的关键性分子机制之一〔1〕。AD病人脑中蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性降低是导致tau蛋白过度磷酸化的主要原因〔2〕。冈田酸(OA)是PP2A的特异性抑制剂。OA通过特异性降低PP2A活性，引起tau蛋白过度磷酸化以及后续的神经细胞凋亡性退化〔3〕。凋亡机制很可能参与AD中神经细胞退化。作者〔4〕在大鼠一侧脑额叶皮质单位点注射OA，出现tau过度磷酸化，且tau过度磷酸化与细胞凋亡有关。Bcl2家族蛋白所调控的线粒体凋亡通路在生理性和病理性凋亡中普遍存在。为了明确Bcl2蛋白是否参与OA所诱导的AD样神经细胞退化，本研究以体外培养的人神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y为研究对象，探讨Bcl2蛋白在蛋白磷酸酶抑制剂OA诱导的AD样神经细胞退化中是否具有细胞保护作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 研究对象 人神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y为中国医学科学院基础所自德国HyperCLDB细胞培养机构引进的连续传代肿瘤细胞株。 　　1.1.2 主要仪器 美国产Forma恒温培养箱，美国产BioRad 450型酶标仪，德国产Leica DMIRB倒置荧光显微镜，北京六一仪器厂产DFC电泳仪、垂直电泳槽和电转槽。 　　1.1.3 主要试剂 美国Gibco BRL公司产 RPMI1640培养基、脂质体Lipofectamine 2000和G418;美国Hyclone 公司产15%胎牛血清(FCS);上海实生细胞生物技术公司进口分装3(4, 5二甲基噻唑2)2,5二苯基四氮唑溴盐 (MTT);美国Sigma 公司产Hoechst 33258，小鼠βactin单克隆抗体，星形孢菌素(STS) 和OA;美国Clontech公司产真核表达质粒PcDNA3;美国Santa Cruz Biotechnology公司产兔Bcl2多克隆抗体和化学发光试剂。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 SHSY5Y细胞常规培养所用的完全性培养基：RPMI1640培养基，15% FCS;15mmol HEPES;100 U/ml青霉素;100 μg/ml链霉素。 　　1.2.2 转染 ①重组质粒构建。真核表达质粒PcDNA3，CMV启动子，多克隆位点(MCS)后接编码Bcl2 的cDNA序列，将该重组质粒命名为PcDNA3bcl2。②稳定转染。脂质体介导重组质粒PcDNA3bcl2和空质粒PcDNA3分别瞬时转染SHSY5Y细胞;细胞常规培养36 h，其间更换一次完全培养基;用梯度浓度的G418确定合适的最低浓度筛选转染成功的细胞，收获克隆细胞培养、传代、冻存。 　　1.2.3 Western印迹鉴定外源性蛋白的表达 对G418筛选出的重组质粒PcDNA3bcl2和空质粒PcDNA3稳定转染细胞进行以下处理：①制备细胞总裂解物;②SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;③转膜;④Bcl2抗体(1∶1 000)和内对照βactin的抗体(1∶1 000)免疫;⑤发光剂作用后显影冲片。 　　1.2.4 转染细胞