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bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能影响 　 作者：史梦，冯文莉，黄世峰，曾建明，王小中 【摘要】 目的： 建立稳定表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3P210的DNA损伤模型，探讨bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能的影响. 方法： 彗星实验检测不同浓度H2O2诱导的BaF3P210细胞的DNA损伤建立DNA损伤模型，以空载体转染BaF3MIGR1细胞为对照；用彗星实验对两组细胞在DNA损伤后的修复进行不同时间段的动态观测. 结果： 彗星实验确定了细胞DNA损伤模型的建立条件是：采用50 μmol/L终浓度的H2O2对BaF3MIGR1细胞和BaF3P210细胞进行染毒，H2O2作用温度和时间均为4℃，10 min. BaF3P210细胞与BaF3MIGR1细胞相比DNA损伤后修复时间缩短，在损伤后60 min即可达到完全修复，而后者在损伤后120 min才能完全修复（Plt;0.05）. 结论： 建立了表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3P210细胞的DNA损伤模型，并发现bcr/abl融合蛋白可增强BaF3P210细胞的DNA损伤后修复能力. 【关键词】 融合蛋白质类，bcr/abl；白血病，髓样，慢性；DNA损伤；DNA修复 0引言 　慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)的发生是由于 t(9；22)(q34；ql1)所致的bcr/abl融合基因编码产生具有强烈酪氨酸激酶活性的bcr/abl融合蛋白，该蛋白异常激活多种信号转导通路而导致血细胞的恶性转化［1］. bcr/abl融合基因的表达可能引起DNA损伤修复功能异常，与CML的发生、发展及耐药性表型密切相关，但具体机制仍然有待阐明［2-3］. 我们以表达bcr/ablP210融合蛋白转化细胞株BaF3P210为对象，以空载体感染细胞株BaF3MIGR1为阴性对照，经H2O2染毒后建立DNA损伤模型，并对细胞在DNA损伤后的修复进行动态观测，探讨bcr/abl对细胞DNA损伤修复功能的影响. 1材料和方法 1.1材料RPMI1640培养基和胎牛血清为Gibco公司产品；低熔点琼脂糖、溴化乙啶（EB）为Sigma公司进口分装，H2O2等试剂均为国产分析纯级产品；倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS），水平电泳仪（BIORAD公司）. bcr/ablP210转化细胞株BaF3P210和空载体感染细胞株BaF3MIGR1由本课题组构建. BaF3P210细胞用含100 g/L FCS的PRMI 1640液培养于含50 mL/L CO2的37℃恒温培养箱中. BaF3MIGR1细胞用含100 g/L FCS, 100 g/L WEHI3条件培养基（细胞生长所需IL3来源）的PRMI1640液培养，培养箱条件同前. 1.2方法 1.2.1建立细胞的实验性DNA损伤模型BaF3MIGR1细胞和BaF3P210细胞细胞（1×108/L）分别用1, 10, 50, 100, 200 μmol/L终浓度的H2O2于4℃下染毒10 min，立即收集细胞进行彗星实验. 以上实验均以100 μmol/L H2O2染毒的细胞作为阳性对照，同体积PBS处理细胞作为阴性对照. 1.2.2检测细胞的DNA损伤后修复实验分组同前. 用造成DNA损伤的最佳条件对各组细胞（1×108/L）染毒后，用PBS洗涤两次除去H2O2，然后用PRMI 1640液重悬细胞，放入37℃培养箱继续培养. 取出部分染毒前和染毒后0, 30, 60, 90, 120 min的细胞，置于冰上终止DNA修复反应，收集细胞进行彗星实验. 1.2.3彗星实验参考Singh等［4］的方法，并稍加改良. 即混合于低熔点琼脂糖中的细胞经1 h裂解，30 min解旋后，在25 V, 200 mA电场下电泳20 min，EB染色，倒置荧光显微镜下观察. 每个样品制片2张，每张载玻片随机选择50个细胞拍照. 用TriTek公司的彗星图像分析软件CometscoreTM 1.5分析实验结果. 以国际公认的Tail Moment(尾矩)为指标衡量DNA损伤水平及修复能力. Tail Moment为复合指标，定义为彗尾DNA百分含量和彗尾长度的乘积，单位为PIX（像素）. 统计学处理： 实验独立重复3次，结果用x±s表示. 采用SPSS14.0统计软件包进行分析： 细胞实验性DNA损伤模型建立的实验结果数据在经对数转换为方差齐同资料后采用单因素方差分析进行组间均值比较，并进一步采用多个均数间两两比较的q检验进行多组间均数的比较；细胞在DNA损伤后的修复能力检测的实验结果数据采用重复测量资料