C6胶质瘤细胞培养上清诱导神经干细胞迁移初步探究.doc

C6胶质瘤细胞培养上清诱导神经干细胞迁移初步探究 　 作者：高树梓，高宜录，林社裕，刘道坤 【摘要】 目的：观察体外培养的胶质瘤细胞在体外能否引起神经干细胞的迁移，从而为研究胶质瘤细胞中存在促进神经干细胞迁移的物质打下基础。方法：分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。以星形胶质细胞为对照，做细胞迁移实验，观察其结果；将C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的无血清培养上清分别浓缩，并行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察其结果。结果：（1）C6胶质瘤细胞的培养上清引起神经干细胞迁移的数目明显多于星形胶质细胞的培养上清和新鲜无血清培养基（P＜0.01）；（2）将无血清培养的等浓度的C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的上清浓缩蛋白电泳，可见二者蛋白条带存在明显差异。结论：（1）从新生大鼠大脑皮层组织可以培养出神经干细胞和星形胶质细胞。（2）C6胶质瘤细胞无血清培养的上清中存在着能够诱导神经干细胞迁移的物质。 【关键词】 胶质瘤细胞；神经干细胞；星形胶质细胞；细胞迁移 已有研究发现胶质瘤细胞而且在体内可以诱导神经干细胞向胶质瘤方向迁移[1，2]。尽管未成熟神经元迁移的机制十分复杂，但其迁移的方向和路径的识别与局部的某种信号物质有关。胶质瘤细胞中是否存在这种信号物质尚未见报道。我们采用体外培养技术，观察C6胶质瘤细胞的培养上清在体外有无诱导神经干细胞迁移的作用。为进一步通过生化技术将胶质瘤细胞中的该信号物质进行分离和纯化打下基础。为将该信号物质与神经干细胞一起应用于临床，提高脑及脊髓损伤、胶质瘤和中枢神经系统退行性疾病的治疗效果奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 （1）实验动物、细胞：新生SD大鼠（由南通大学实验动物中心提供）；C6胶质瘤细胞株（中科院上海细胞所）。（2）试剂及抗体：DMEM/F12，B27 Serum-Free Supplement（Invitrogen公司）；碱性成纤维生长因子 (Peprotech公司)；5-溴-2脱氧尿苷(Neomarkers公司)；小鼠抗-Nestin IgG1（Chemicon公司）；小鼠抗5-溴-2脱氧尿苷IgG1（Neomarkers公司）；小鼠抗胶原纤维酸性蛋白IgG1和异硅氰酸荧光素抗小鼠IgG（Sigma公司）。 　　1.2 细胞培养及鉴定方法 （1）神经干细胞的培养及鉴定：从新生SD大鼠大脑皮层分离培养神经干细胞。用无血清培养基DMEM∕F12培养约7d，使得神经干细胞处于指数生长期。贴壁、固定、洗涤后用含10%羊血清、0.3% Triton-100的0.01mol/L PBS液在37℃条件下封闭孵育10min。加一抗（小鼠抗Nestin IgG，1∶500倍稀释），4℃过夜，洗涤加入二抗（FITC标记的羊抗小鼠IgG，按1∶150稀释），避光37℃孵育30min。共聚焦显微镜下观察。细胞传代能力鉴定5-溴-2脱氧尿苷免疫荧光检测：将获得的原代神经球吹打制成单细胞悬液，接种至含5-溴-2脱氧尿苷浓度为5μmol/L的培养液中培养5~7d即可形成次代神经球。贴壁、固定、封闭，免疫荧光染色和观察均同前。小鼠抗5-溴-2脱氧尿苷IgG1按1∶1000倍稀释，FITC标记的羊抗小鼠IgG，按1∶200倍稀释；（2）星形胶质细胞的培养及鉴定：从SD新生红皮鼠大脑皮层分离星形胶质细胞，用含20%小牛血清培养基DMEM/F12培养约28天，使得星形胶质细胞处于指数生长期。免疫荧光法检测培养细胞的胶质原纤维酸性蛋白表达方法同前。小鼠抗胶质原纤维酸性蛋白IgG1，按1∶500倍稀释,FITC标记的羊抗小鼠IgG，按1∶200倍稀释；（3）C6胶质瘤细胞培养：用含20%小牛血清的DMEM/F12培养基培养4~6d，待细胞生长处于对数期时使用；（4）细胞迁移实验：用多聚碳酸膜有8μm微孔的“Transwell” 细胞培养室进行迁移实验。细胞迁移实验前36h，把培养C6胶质瘤细胞和星形胶质细胞的含小牛血清的上清去掉，用0.01mol/L PBS冲洗3遍，然后换上无血清的DMEM/F12培养基培养36h。迁移实验时共分3组，基本培养基为第1组：在细胞培养室的下室加入无血清培养基600μl；C6细胞培养上清为第2组：在细胞培养室的下室加入C6细胞无血清培养基培养的上清400μl和200μl无血清培养基；星形细胞培养上清为第3组：在细胞培养室的下室加入星形胶质细胞无血清培养基培养的上清400μl和200μl无血清培养基。在上述3组的细胞培养室的上室加入神经干细胞悬液（6.7×102个/ml)200μl,共培养36h。取出培养杯，甲醇固定10min，PBS洗3次； Giemsa染色10min，PBS洗3次；用解剖刀取下膜，转置在自制的带网格的载玻片上，取中间9个格进行光镜下放大100倍计数。 　　1.3