Klotho蛋白对C57BL-6小鼠黑质神经元数目影响.doc

Klotho蛋白对C57BL/6小鼠黑质神经元数目影响 　 作者：期杜洪霞 周芳 张湛睿 李新华 弥曼 【摘要】 　　目的 观察Klotho蛋白对C57BL/6小鼠黑质神经元数目的影响并探讨其可能机制。方法 C57BL/6小鼠分3组：野生型雄性小鼠（WT），Klotho基因过表达型（Tg）小鼠，Klotho基因敲除鼠（KO）各6只，行为学观察及体重测定，用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学法观察黑质神经元的变化。结果 KO小鼠与WT、Tg组小鼠相比体重明显降低（Plt;0.01）。WT组小鼠与Tg组小鼠相比体重差别不显著（Pgt;0.05）；与WT小鼠相比KO组小鼠脑黑质神经原数目上调而Tg组小鼠脑黑质神经原数目下调，三组间均有显著性差异（Plt;0.01）。结论 Klotho基因可影响黑质纹状体内多巴胺能神经元的数目。与WT组小鼠相比KO小鼠脑黑质神经原数目上调而Tg小鼠脑黑质神经原数目下调，可能是KlothoFGF23共受体存在负反馈调节机制的影响。 【关键词】 Klotho蛋白；多巴胺能神经元；黑质 　　Klotho蛋白与人类衰老密切相关〔1〕，该蛋白缺陷鼠可出现一系列与人类衰老相似的多种行为和病理变化：寿命缩短、运动失调、性功能障碍、痴呆、白内障、动脉粥样硬化、骨质疏松、肺气肿和免疫功能降低等；基因敲除小鼠的步态异常，平均步长明显缩短，类似人类帕金森病（PD）患者的步态；使用一定的方法使小鼠重新获得基因，上述各种症状均能缓解〔2〕。研究人员应用基因技术培育出的Klotho基因蛋白水平是正常小鼠2～2.5倍的实验小鼠，结果证实这种小鼠的生存寿命要比正常野生型小鼠延长20%～30%〔3〕。Klotho蛋白对MPTP诱致PD模型小鼠具有神经保护作用〔4〕，本实验将研究Klotho基因对C57BL/6小鼠黑质神经元数目的影响并探讨其可能机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂与仪器 　　MPTP购自美国Sigma公司；酪氨酸羟化酶（TH）抗体购自美国Protos Biotech公司；TH免疫组化试剂盒、DAB试剂购自美国Vector Laboratories公司。 　　1.2 动物分组 　　C57BL/6野生型（wild type，WT）雄性小鼠，Klotho基因过表达型（Klotho overexpressing，Tg）小鼠，Klotho基因敲除（Klotho knockout，KO）鼠各6只，8～10周龄，由美国西南医学中心病理学系饲养并提供。在18～20℃的室温和相对湿度为50%～60%的昼夜循环光照条件下生活，自由饮水、取食，人工昼夜节律（12～12 h）。 　　1.3 行为学观察及体重测定 　　观察各组小鼠的外观、表型及行为学异同。包括：皮肤正常或萎缩、变薄、毛囊数量减少；自发活动增加、减少、蹿跑、蜷缩不动、活动减少和步态紊乱；体毛正常或稀少；肌肉运动增强、减弱、失调、震颤、抽搐、麻痹、共济失调；消瘦、懒动和驼背。并测各组小鼠体重。 　　1.4 TH免疫组织化学染色 　　1.4.1 取材及冰冻切片 　　小鼠断头取脑组织，入含50 mg/ml多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲固定液（PBS）中，4℃固定6 h，再入含250 g/L蔗糖的PBS溶液内4℃过夜至脑组织块沉入瓶底。于冠状黑质平面将脑组织块连续冰冻切片，片厚30 μm。所切连贯切片按序号保存于PBS液内，每只鼠所得黑质致密部（SNc）切片中隔5取1共取5张连贯切片进行TH免疫组织化学染色。各组切片选取部位尽量一致。 　　1.4.2 TH染色 　　切片置入0.1 mol/L PBS(pH 7.4)冲洗3次每次10 min；PBS+H2O2（2∶1）冲洗30 min；0.1 mol/L PBS冲洗3次每次10 min；切片入滴加血清3滴10 ml PBS溶液中孵育30 min；加一抗(1∶４ 000，用抗体稀释液稀释) ，并于湿盒内4℃过夜；第2天PBS冲洗3次，每次10 min；滴加生物素标记的二抗工作液，孵育30 min；PBS冲洗3次，每次10 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，孵育1 h；PBS冲洗3次每次10 min；Acetate缓冲液冲洗10 min；DAB显色４～5 min；Acetate缓冲液冲洗10 min，PBS冲洗3次，每次10 min；梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后镜下观察并照相。DAB显色液中加入Nickel，阳性细胞为细胞质和突起着蓝色。 　　1.4.3 阳性细胞计数 　　应用StereoInvestigator软件，对照图谱，在低倍视野下勾出SNc边界〔5〕，选定计数范围，高倍视野下计数设定选取框内阳性细胞数，顺序由左至右，由上至下，不完全位于视野内的细胞不计数；分析TH阳性细胞计数结果，统计