LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及释放实验探究.doc

LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及释放实验探究 　【摘要】 目的：观察LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及其释放。方法：用不同浓度的LPS处理小鼠RAW264.7细胞20 h，用荧光显微镜观察LPS诱导RAW264.7细胞HMGB1的分布情况。用Western blot方法检测HMGB1在胞核及培养上清中的水平。结果：LPS处理小鼠RAW264.7细胞20 h后，培养上清中的HMGB1水平明显增加，胞核HMGB1含量减少，并存在剂量依赖关系。结论：LPS能诱导RAW264.7细胞释放HMGB1，存在剂量依赖关系。 【关键词】 LPS RAW264.7细胞 HMGB1转位和释放 Abstract Objective：The purpose of this study was to investigate the translocation and release of HMGB1 in LPS-induced RAW264.7 cell. Methods:RAW264.7 cells were incubated with different concentrations LPS for 20 hours, the distribution and levels of HMGB1 in RAW264.7 cells were subsequently analyzed by immunofluorence and Western blot,respectively.Results:HMGB1 accumulation in the culture media of LPS-induced RAW264.7 cells was significantly increased, and the accumulation of HMGB1 in the nucleus was remarkably reduced. Conclusion: LPS can induce significant release of HMGB1 in RAW264.7 cells in a dose-dependent manner. Key words LPS;RAW264.7 cells; HMGB1 Translocation and release 以往研究表明，内毒素可刺激TNF-α、IL-1等早期细胞因子的合成和释放，被认为是动物多器官功能损害和死亡的核心因子。但抗TNF-α抗体治疗脓毒症的临床研究并未取得预期效果。新近研究发现，巨噬细胞可以产生一种新的细胞因子—高迁移率组蛋白B1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）。该细胞因子具有释放晚、持续时间长的特点，被认为是引发机体炎症级联反应的重要介质。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性杆菌的主要致病成份，本实验重点探讨LPS对RAW264.7细胞内HMGB1转位及其释放的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 RAW264.7细胞由上海细胞生物所细胞库提供；RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司；新生牛血清购自杭州四季青生物制品公司；荧光免疫分析试剂盒购自苏州新波生物技术有限公司。 1.2. RAW264.7细胞的培养 复苏后的RAW264.7细胞置于含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、10%新生牛血清、2 mol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中培养。37 ℃ 5%CO2孵箱培养，待细胞铺满80%后以0.25%酶、0.02% EDTA 消化，传代培养4次以后（达对数生长期）调整细胞浓度为4×105/L（用于免疫荧光）或4×106/L（用于提取蛋白质），转种于放置了无菌处理盖玻片的6孔细胞培养板中，置37 ℃5% CO2孵箱培养，细胞单层融合达80%后，换无血清的RPMI 1640培养液，孵育2 h用于实验。 1.3. LPS诱导RAW264.7细胞HMGB1转位实验 以50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、250 ng/mL 500 ng/mL不同剂量的LPS刺激，均于刺激20 h后，取出培养孔内载玻片，进行免疫荧光实验，显微镜下观察并拍照。 1.4 细胞活性鉴定 台盼蓝拒染实验：将刺激后的细胞用EDTA消化后吹打成单细胞悬液，取0.5 mL 0.4%的台盼蓝染液、0.3 mL HBSS和0.2 mL细胞悬液，充分混匀。用毛细吸管吸取少量混合液，注入血细胞计数板小室，计数其中着色的细胞。 1.5. HMGB1蛋白的表达测定 Western blot方法测定： 上样量为30 μg将待测样品与一倍量上样缓冲液混匀，封口，放