DIG试剂盒说明书(CSPD)中文翻译版.doc

只用于生命科学研究，不能用于诊断程序 仅用于体外实验 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用CSPD化学发光检测，随时即用。 货号：11 585 614 910 此试剂盒储存条件：-15℃到-25℃。 此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行12次标记反应， 可检测10×10cm2面积的杂交膜24张。 指导手册 2005.12 版 1 前言 1.1 内容表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2.介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程图 3.3 地高辛标记DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫检测 3.8 DNA印记的洗脱和再杂交 4. 附录 4.1 故障排除 4.2 参考文献 4.3 订购信息 1.2 试剂盒的成分 瓶号 标记 内容 包括功能 1 DIG-高效引物 50μL 地高辛标记的高效引物 5×浓度的标记混合物：优化的浓度的随机引物，核苷酸，地高辛标记的dUTP（碱标记的），Klenow酶和缓冲液成分 随时可用 澄清的粘液 用于DNA的高效随机引物标记 2 DIG标记的对照DNA 20μL 5μg/mL 质粒pBR328 DNA （用Bam HI线性化） 澄清溶液 用于确定标记效率 3 DNA稀释缓冲液 3管1mL 50μg/mL鱼精DNA,10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH8.0 在25℃ 澄清溶液 4 抗地高辛的碱性磷酸酶结合物 50μL 750U/mL 从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶 澄清溶液 5 CSPD 随时可用 50mL CSPD 澄清溶液 6 封闭液 4×100mL 10×浓度 黄色，粘液 7 地高辛杂交颗粒 100mL地高辛杂交液共4瓶，用于DNA杂交 附加仪器与所需试剂 除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。 在每个操作程序的前面提供了详细的信息。 操作程序 仪器设备 试剂 3.3 DIG-DNA标记 水浴 灭菌的双蒸水 0.2M pH8.0 灭菌的EDTA 3.4 标记效率的半定量 带正电荷的尼龙膜* 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 3.5 DNA转移和固定 紫外光盒 或者商业化可用于紫外交联的其他设备 20×SSC 或者10×SSC 3.6 杂交 尼龙膜，带正电荷* 杂交袋*， 或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶 注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。 3.7 免疫检测 耐热的塑料袋或者滚筒瓶 杂交袋* 地高辛洗涤和封阻缓冲液组合*，或者 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 3.8 DNA 斑点的脱色和重新标记探针 大的托盘 水浴 10×SSC 10%SDS 0.2M NaOH *标记的产品可以从Roche Applied Science 获得。 2.介绍 2.1 产品概况 实验原则 此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测[1,2,3]。 步骤 描述 DNA 标记 根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标记的DNA探针。地高辛标记的高效引物是一种专门生产的反应混合物，其中含有地高辛dUTP,碱性标记（图1）和所有的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先混合优化的5×浓度反应缓冲液。 杂交 根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP能够更加容易和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交。 免疫检测 杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测，Fab段，然后采用即时可用的化学发光底物CSPD可以看到杂交结果。采用碱性磷酸酶可以对CSPD进行，酶的脱磷酸化，导致在最大波长477nm处有光的发射（图2），这一现象可以用适合的图像仪或者X光片进行记录。胶片的曝光时间范围只在5-30分钟内。 图1 DIG-dUTP ，碱性标记 图2 CSPD反应 应用 地高辛标记DNA探针可以用于： 所有类型的滤膜杂交 总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物体也可以进行检测，如人，大麦和小麦。 样品材料 至少100bp的DNA片段 线性的质粒，cos质粒或者DNA 超螺旋的DNA 实验时间 此表格列出了每一步实验所需的反应时间。 步骤 反应时间 DNA标记 1小时-过夜 杂交