试验操作技术-2010512142413.doc

血凝抑制（HI）试验 1 阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4保存备用。 2 10%和1%鸡红细胞液的制备 2.1采血 用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。 2.2 洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4保存备用，不超过5天。 2.3 10%鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。 2.4 1%鸡红细胞液 取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mL生理盐水，混合均匀即可。 3 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法） 3.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。 3.2吸取0.025mL病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）加入第l孔，混匀。 3.3从第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。 3.4每孔再加入0.025mL PBS。 3.5每孔均加入0.025mL 体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）见附录B。 3.6振荡混匀，在室温（20～25）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。 3.7结果判定 将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表）。 表1：血凝试验结果判读标准 类别 孔 底 所 见 结果 1 2 3 4 5 红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集 红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈 红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块 红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块 红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集 ++++ +++ ++ + - 能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效。 4 血凝抑制（HI）试验（微量法） 4.1 根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。 4.2 在微量反应板的1孔～11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。 4.3 吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。 4.4 1孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20）静置至少30min。 4.5 每孔加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20，若环境温度太高可置4条件下进行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。 4.6 结果判定 以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。 只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性；HI价等于31og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于41og2为阳性。 正向间接血凝试验（IHA） 1 原理 用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）。 抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。 主要用于检测O型口蹄疫免疫动物血清抗体效价。 试验器材和试剂 .1 96孔110°V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板 .2 微量移液器（50μL 25μL）取液塑咀