一种简捷的Southern印迹杂交方法＋.PDFVIP

第43卷第4期 tfI山大学学报(自然科学版) V01．43No．4 2004年7』j ^,CFASCIENl’IARUMNATURALIUMUNIVERS兀ATIS Jul．2004 一种简捷的Southern印迹杂交方法+ 朱华晨，许新萍，李宝健 (中山大学生物工程研究中心／／基因工程教育部重点实验室，广东广州510275) 摘 要：在综合前人方法的基础上，发展了一种简捷、灵敏、廉价、效果可靠的Sout}1em印迹杂交方案。使用 0．4mol／L NaOH溶液将琼脂糖凝胶上的DNA在变性的同时转移到尼龙膜上，晾于膜后无需固定就可以直接用于 杂交。预杂交液和杂交液选用Church缓冲系统，该缓冲系统中仅需10BSA作为封闭剂即可。整个洗膜过程 g／L 可简化为一种溶液、2—3次洗涤。碱变性及转移后的尼龙膜，也可以用于地高辛(DIG)等非放射性检测系统， 并可耐多轮杂交和洗脱。本方法可适用于包括高等植物基因组在内的多种生物材料的DNA检测。 关键词：SoutIlem印迹；DNA；杂交；植物基因组 中图分类号：Q一33；Q503文献标识码：A 文章编号：0529．6579(2004)04．0128．03 Southem印迹杂交是分子生物学中一种常用的湿润和平衡； 关键性DNA检测技术。传统的Southem杂交，步(5)按照说明书安装好真空转膜装置 VacuGeneXLVacuum 骤繁琐，试剂昂贵，配方复杂，操作起来既费时费 (BiometraVB21型或Pharmacia 力费钱还容易出错。本文吸收了前人文献[1。81中各BlottingSystem)，取出凝胶置于膜上，排除气泡； mol／L 种实验方案的优点，结合新一代尼龙膜的优良特 (6)在凝胶上加满O．4NaOH溶液(此溶 性，发展了一种简便、快速、灵敏、廉价，且重复 液回收后可重复使用)，开动真空泵，50mbar(相 性强的DNA印迹杂交方法。 当于5×l护Pa)转膜0。5—2h，随时补加溶液以保 1材料和方法 持凝胶上有足量的NaOH溶液； 1．1主要试剂和仪器 (7)转移结束后，‘关闭真空泵，将凝胶取下， 预杂交液成分：10 BSA(组分V，上海生取出尼龙膜； s／L 工)，lmmol／L 8．0)，0．5mol／L磷酸钠 EDTA(pH 6．8—7．5)，70 缓冲液(pH g，LSDS； min，除去膜上的杂质和附 s／L)溶液浸泡尼龙膜5 洗膜液成分：磷酸钠缓冲液(40mmol／L)一着的琼脂糖碎片(推荐)； EDTA(1mmol／L)一SDS(1 s／L)或0．1×SSC— (9)用0．1×SSC略加浸洗，除去膜上的杂质 SDS(1 s／L)；有关缓冲液的配制参见文[4]。 (琼脂糖碎片或残存的SDS)； 1．2方法以下操作程序中，标有“(推荐)” (10)在家用微波炉里以中火烤膜3min(注意 字样的步骤可以省略不做。 同时在炉里放一小杯水，以保护微波炉不致损坏) (1)将DNA点样于琼脂糖凝胶上，待电泳至(推荐)； 所需程度后