SAGE基因表达的系列分析方法.ppt

SAGE 基因表达系列分析 Serial Analysis Of Gene Expression 是通过快速和详细分析成千上万个EST（express sequenced tags）来寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序列。 主要应用：全基因组基因表达分析、寻找差异基因、发现新基因。 能同时对大量的转录物进行定性和定量的分析，可以同时反映正常或异常等不同功能状态下细胞整个基因组基因的全貌，特别对低丰度表达基因有较高的检测结果。它不但能快速详细的分析成千上万个基因转录子的丰富信息，还能发现新的基因。 SAGE的原理 SAGE的主要依据有两个: 1、一个9～10碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录物。例如，一个9碱基顺序能够分辨262144个不同的转录物，而人类基因组估计仅能编码80000种转录物，所以理论上每一个9碱基标签能够代表一种转录物的特征序列。 2、如果能将9碱基的标签集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析。 常规 SAGE方法的操作步骤及原理 1、生物体特定阶段组织或细胞中全部mRNA的制备。 2、cDNA的双链的合成 以biotinylated oligo(dT）为引物将mRNA反转录合成cDNA 。 3、锚定酶酶切 锚定酶具有4bp的识别位点，常用的锚定酶如：NlaⅢ，其酶切位点为CATG 4个碱基序列。酶切后产物通过生物素磁珠（链霉素抗生物素蛋白珠）分离含polyA尾的cDNA片段，将此产物平均分为2份。 4、cDNA片段与接头（Linker）的连接 接头包括4条链：Linker 1A、Linker 1B、Linker 2A、Linker 2B。将Linker 2A以及Linker 2B末端去磷酸化，并与相应的Linker 1A以及Linker 1B进行退火形成接头Linker 1和Linker 2.（接头末端含有锚定酶以及标签酶酶切位点）。 5、标签酶酶切释放标签序列 标签酶是一种Ⅱ类限制酶，它能在距识别位点约20碱基的位置切割DNA双链。 6、连接形成双标签（Ditages） 将含有Linker 1和Linker 2的标签在连接酶的作用下连接形成Linker1、2的双标签。 常规 SAGE方法的操作步骤及原理 7、PCR扩增（Ditages） PCR扩增依据Linker 1和Linker 2序列设计。只有含有Linker 1和Linker 2的双标签才能得到有效的扩增。采用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物，回收102bp的扩增片段。 8、分离纯化双标签 采用锚定酶酶切回收的扩增产物，酶切产物采用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳回收6bp的片段，即得双标签。 9、双标签随机连接形成串联子（Concatemers） 纯化的双标签采用连接酶使之成锁链状形成不同大小的串联子。8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳回收一定片段长度的串联子。 10、克隆串联子、测序 将串联子克隆至含Sph Ⅰ酶切位点的pZero载体中，测定串联子的序列。 11、计算机辅助分析 测序结果采用SAGE软件包进行分析，获得标签序列及其丰度信息，每个标签可通过与Genbank数据库或者EST数据库数据进行对比，从而可确认其代表的基因。 SAGE的优点和应用 SAGE是一项快捷、有效的基因表达研究技术，任何具备PCR和手动测序器具的实验室都能使用这项技术，结合自动测序技术能够在3个小时内完成1000个转录物的分析。另外使用不同的锚定酶（识别5～20碱基的Ⅱ类核酸内切酶），使这项技术更具灵活性。 1、SAGE可应用于人类基因组研究。 SAGE能够快速、全范围提取生物体基因表达信息，对已知基因进行量化分析。SAGE也能应用于寻找新基因。虽然SAGE的标签仅包括9个碱基，但加上锚定酶的位点序列（4个碱基）共可确认13碱基序列。 2、SAGE可用于定量比较不同状态下的组织细胞的特异基因表达。 Stephen·L等（1997）利用SAGE技术比较小鼠胚囊纤维细胞基因表达。小鼠胚囊纤维细胞能产生对温度敏感的P53肿瘤抑制蛋白，就可通过SAGE分析，比较两种不同温度下基因表达的差异。从约15 000个分析的基因中，发现有14个基因的表达依赖于P53蛋白，有3个基因的表达与P53蛋白的失活显著相关。 3、由于SAGE能够同时最大限度的收集一种基因组的基因表达信息，转录物的分析数据可用来构建染色体表达图谱（Chromosomal expression map）。 利用基因的表达信息与基因组图谱融合绘制的染色体表达图谱，使基因表达与物理结构连系起来，更利于基因表达模式的研究。 4、