新城疫病毒DF一1细胞蚀斑纯化方法的建立-中国动物卫生与流行病学.PDF

中国畜牧兽医 2014年第 41卷第 6期 生物技术 新城疫病毒 DF一1细胞蚀斑纯化方法的建立 赵明 ，戈胜强 ，王静静 ，赵云玲 ，郑东霞 ，左媛媛 ，于松梅 ，王晓真。， 刘春菊。，王英丽。，刘华雷。，包静月。，吴晓东 ，单虎 ，王志亮 (1．青岛农业大学动物科技学院，山东青 岛 266109；2．中国动物卫生与流行病学中心，山东青 岛 266032) 摘要 ：本研究对 DF一1细胞 的培养条件及新城疫病毒 (NDV)DF-1细胞 的蚀斑纯化方法进行了优化摸索，结果显示相较于 DMEM培养基 ，DF-1细胞更适宜在含 15 胎牛血清 的DMEM／F12培养基 中生长 ，DF-1细胞 以3×10／$L的剂量覆盖 6孔 板能获得最佳 的铺板效果，吸附病毒后 1．5h覆盖第 1层琼脂 ，48h后覆盖第 2层琼脂能获得最佳 的蚀斑形成效果 。通过对 蚀斑纯化株 F和HN 基因测序分析 ，结果表 明蚀斑纯化后无任何变异 。通过此方法可在 1个星期之 内获得稳定的纯化毒株 ， 方法简单、可重复性强、纯化效率高 。 关键词 ：新城疫病毒 ；DF-1细胞 ；蚀斑纯化 中图分类号：$852．65 文献标识码 ：A 文章编号：1671—7236(2014)06-0051-04 新城疫病毒 (NDV)属于副黏病毒科 ，是重要的 因此各种疫苗毒、野毒广泛存在。同时临床 中NDV 人畜共患病病原。目前国内流行的NDV毒株主要 能与禽流感病毒、鸡传染性法 氏囊病病毒、腺病毒等 为基因 7型(孙丰廷等，2012)和Class工(刘华雷等 ， 混合感染 ，且有文章证明，从免疫失败 的病死鸡体 2009)系列毒株 。由于中国新城疫 (ND)疫苗免疫频 内分离到 的 NDV常呈强、弱毒株混合存在现象 繁，且现用疫苗不能有效阻挡病毒排毒 (Hu等，2009)， (Takehara等 ，1987)，因此临床 中经鸡胚接种法分 离到的NDV常为病毒混合体 。如需对分离到 的 收稿 日期 ：2013-11—25 NDV进行进一步的毒力鉴定 、全基 因测序分析及 作者简介 ：赵明(1989一)，女 ，山东人 ，硕士生，研究方 向：动物传 染病防治与生物制品学 。 攻毒保护等试验 ，必须对分离到的病毒进 行病毒 戈胜强(1982一)，男，山东人 ，博士 ，研究方 向：病毒样 纯化 。本试验对 DF一1细胞纯化 NDV 的条件进行 颗粒疫苗构建及新城疫病毒 、禽流感病毒 、外来动物 了摸索优化 ，旨在确定使用 DF一1细胞进行蚀斑纯 疫病病原分子生物学 。 赵明和戈胜 强对本文具有相 同贡献，并 列为第一 化的最佳条件 ，以替代 CEF细胞蚀斑纯化方法和 作者 。 鸡胚终点稀释法来纯化 NDV，为其快速分离奠定 通信作者 ：单虎 ，教授。E—mail：shanhu67@163．tom 基础 。 王志亮 ，研究员。E—mail：wangzhiliang@cahec．cn 1 材料与方法 基金项 目：公益性行业 (农业)科研专项经 费 (201303033)；科技 基础性工作专项(2012FY111000)。 1．1 NDV毒株及DF-1细胞株 NDV基因7型临 EstablishmentofSYBR Green IReal-timeFluorescent QuantitationPCRforDetectionofGallinacin-