第5章 高效液相色谱.ppt

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第5章 高效液相色谱

第二十章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography,HPLC) 20-1概述 HPLC是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术,随着不断改进与发展,目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上,引入了气相色谱的理论,在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器,因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性,现从两方面进行比较: 1.高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料,流出速度极慢;而HPLC配备了高压输液设备,流速最高可达 103cm·min-1.例如分离苯的羟基化合物,7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离,用经典色谱法,柱长约170cm,柱径0.9cm,流动相速度为30cm3·h-1,需用20多小时才能分离出20种氨基酸;而用高效液相色谱法,只需lh之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb-ODS(5μ)的柱,采用梯度洗脱,可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。 2.高效液相色谱法与气相色谱法 (l)GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物,它们仅占有机物总数的20%。对于占有机物总数近80%的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质,目前主要采用HPLC进行分离和分析。 (2)GC采用流动相是惰性气体,它对组分没有亲和力,即不产生相互作用力,仅起运载作用。而HPLC中流动相可选用不同极性的液体,选择余地大,它对组分可产生一定亲和力,并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此,流动相对分离起很大作用,相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数,这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 (3)GC一般都在较高温度下进行的,而HPLC则经常可在室温条件下工作。 总之,HPLC是吸取了GC与经典液相色谱优点,并用现代化手段加以改进,因此得到迅猛的发展。目前HPLC已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质,例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 HPLC的仪器设备费用昂贵,操作严格,这是它的主要缺点。 20-2 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见图20-1,一般可分为4个主要部分:高压输液系统,进样系统,分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置:如梯度淋洗,自动进样及数据处理等。其工作过程如下:首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱,然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时,流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离,然后依先后顺序进入检测器,记录仪将检测器送出的信号记录下来,由此得到液相色谱图。 1.高压输液系统 由于HPLC所用固定相颗粒极细,因此对流动相阻力很大,为使流动相较快流动,必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件,一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成,其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好,输出流量恒定,压力平稳,可调范围宽,便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下,输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关;恒压泵是指能保持输出压力恒定,但其流量则随色谱系统阻力而变化,故保留时间的重视性差,它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵,它又分机械注射泵和机械往复泵两种,应用最多的是机械往复泵。 2.进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多(约5~30cm),所以柱外展宽(又称柱外效应)较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽,主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素,因此HPLC中对进样技术要求较严。 3 分离系统—色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件,它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限,故金属管用得较多。一般色谱柱长5~30cm,内径为4~5mm,凝胶色谱柱内径3~12mm,制备往内径较大,可达25mm 以上。一般在分离前备有一个前置柱,前置柱内填充物和分离柱完全一样,这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和,使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相,保证分离技的

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