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第六章 核酸的分离与纯化 李建平 第一节 核酸分离与纯化的设计与原则 导言 核酸分离与纯化是研究核酸性质与功能的基础，核酸样品的制备质量直接影响到核酸的研究与应用。 核酸的存在形式（DNA） 核酸(nucleic acid)：包括DNA与RNA两类分子。 □真核生物的DNA：染色体DNA与细胞器DNA。 真核生物细胞内的核酸均与蛋白质结合成核蛋白(nucleoprotein)。 DNA与蛋白质结合：脱氧核糖核蛋白 RNA与蛋白质结合：核糖核蛋白 □原核生物的DNA：双链环状DNA(包括质粒DNA） □非细胞型的病毒颗粒DNA：双链环状、单链环状、双链线状和单链线状。 核酸的存在形式（RNA） □RNA： 由于RNA的功能是多样性的，因此RNA的种类、大小和结构都具有多样化。 DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不同的。 一、材料与方法的选择 (一)材料与方法的选择 如何恰当地收集与准备材料，选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。 临床常见的标本： 有血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等，有些标本是新鲜的，有些标本是陈旧的。 (二)选择原则： 1、保证核酸一级结构的完整性，是核酸结构和功能研究最基本要求。 2、尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。 （三）影响核酸完整性的因素 影响核酸完整性的因素很多，包括物理、化学与生物学因素。 ●可以避免的有害因素： 避免过酸、过碱、高温加热 ●无法避免的有害因素 ： 1、缩短有害因素对核酸的作用时间； 2、抑制核酸酶的活性。 在不影响核酸质量的情况下，应选择安全无毒的试剂与方案。 二、技术路线的设计 (一)核酸的释放 ■机械法： △液体剪切法 △固体剪切法 ■非机械法： △干燥法 △溶胞法 (二)核酸的分离与纯化 利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分离。 核酸与其它物质的差异 1、细胞定位与组织分布上的差异； 2、物理化学性质上的不同； 3、以及各自独特的生物学特性。 应该去除的污染物 非核酸的大分子污染物； 非需要的核酸分子； 对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。 (三) 核酸的浓缩、沉淀与洗涤 ■常用的方法：有机溶剂沉淀法 ■原 理： 核酸可与钾、钠，镁等阳离子形成盐，屏蔽带负电的磷酸基团，使DNA分子聚结在一起而不溶于许多有机溶剂。 常在加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。 ■常用的盐类： 有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氧化镁等。 ■常用的有机溶剂：有乙醇、异丙醇和聚乙二醇。 三、鉴定与保存 (一)核酸的鉴定 1．浓度鉴定 (1)紫外分光光度法： (2)荧光光度法： 2．纯度鉴定 (1)紫外分光光度法： (2)荧光光度法： 3．完整性鉴定 (1)凝胶电泳法： (2)其它方法：（略） (二)核酸的保存---DNA的保存 TE缓冲液： 可以减少DNA的脱氨反应。 EDTA： 通过螯合Mg2+、Ca2+等二价金属离子可以抑制DNA酶的活性。 低温条件：在4oC条件下可保存较长时间。 氯仿： 在DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染。 (二)核酸的保存---RNA的保存 RNA可溶于0.3mol／L的醋酸钠溶液或双蒸水中，在-70oC至-80oC保存。 1、抑制RNA酶对RNA的降解； 2、有机溶剂的加入。 注意： RNA酶抑制剂或有机溶剂的加入只是一种暂时保存的需要，如果它们对后继的实验与应用有影响，则应予以去除。 第二节 基因组DNA的分离与纯化 一、分离与纯化的方法 哺乳动物细胞基因组DNA的提取 (一)酚抽提法 以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品 (二)甲酰胺解聚法 甲酰胺解聚法，其中细胞裂解与蛋白质水解步骤同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物(即染色质)，然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。 甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与DNA的复