免疫学检测技术的基本原理(1学时).pptVIP

* 磁珠分离法 免疫吸附分离法 流式细胞术 肽—MHC四聚体技术 淋巴细胞及其亚群的分离 * 免疫吸附分离法 加入淋巴 细胞悬液 anti-CD4 anti-CD4 anti-CD4 弃上清 * 磁珠分离法 * 流式细胞术 荧光抗体标记混合细胞 喷嘴 单细胞悬液 5000-10000个/秒 细胞分选器 荧光 检测器 * 抗原肽-MHC四聚体分离技术 亲和素 抗原肽 MHC I 生物素 anti-CD8 肽-四聚体 肽特异性CD8T CD4T及B 非肽特异性CD8T 荧光素 * 二、免疫细胞功能的测定 T细胞功能测定 B细胞功能测定 细胞因子检测 T细胞增殖试验 迟发型超敏反应的检测 抗体含量测定 溶血空斑试验 巨噬细胞吞噬试验 细胞毒试验 吞噬功能测定 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞染色法 凋亡细胞检测法 硝基蓝四氮唑试验 生物活性检测法 免疫学检测法 * T细胞功能测定 T细胞增殖试验 迟发型超敏反应的检测 T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测： 形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁； 3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。 MTT (四甲基偶氮唑盐)比色法： 外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染、免疫缺陷病、肿瘤患者免疫功能测定。 * B细胞功能测定 抗体含量测定 溶血空斑试验 可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。 绵羊红细胞(SRBC)免疫动物 4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞 脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中混匀 在抗体形成细胞周围出现溶解的透明区，即溶血空斑。1个空斑区代表1个浆细胞 通过记录溶血空斑的数目可知抗原特异性B细胞的数目 加入新鲜补体，倒入平皿中培养 * 细胞毒试验 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞染色法 靶细胞被杀伤后，向体系中加入台盼兰，可进入膜破损的细胞内，将细胞染成蓝色。活细胞拒染而不着色。 * 凋亡细胞检测法 琼脂糖电泳法 正常细胞基因组DNA 凋亡细胞 TUNEL法 在细胞中加入末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和生物素标记的核苷酸 TdT能在游离的DNA3’端缺口连接标记的核苷酸 加入亲和素-酶复合物，在DNA断裂处显色 * 巨噬细胞吞噬试验 吞噬功能测定 硝基蓝四氮唑(NBT)试验 在杀菌过程中产生反应性氧中间物，其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中。光镜下计数NBT阳性细胞可反映PMN的杀伤功能。 将待测mf与鸡红细胞混合温育后，鸡红细胞被mf吞噬，根据吞噬百分率确定mf吞噬能力。 吞噬百分率=吞有红细胞的mf/mf总数 * 细胞因子检测 生物活性检测法 免疫学检测法 夹心ELISA 荧光素标记抗体染胞内细胞因子，FACS分析 细胞增殖或增殖抑制法，如细胞因子依赖性或抑制性细胞株 细胞病变抑制法，如干扰素抑制病毒感染性细胞损伤 分子生物学技术检测法 酶联免疫斑点试验 * 检测B细胞产生的抗体 检测T细胞产生的CK 酶联免疫斑点试验-ELISPOT * 复习题 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素。 定义 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 检测抗原或抗体的试验方法有哪些？ 免疫细胞功能检测的方法？ * L/O/G/O * * 免疫学检测技术的基本原理 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素 体内：抗原+抗体→免疫反应 体外：抗原+抗体→进行检测 检测抗原和抗体的体外实验(血清学实验） 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 蛋白质芯片技术 免疫细胞功能的检测 * 第一节 体外抗原抗体反应的特点及影响因素 （一）抗原抗体反应的特点 1. 特异性 2. 可逆性 3. 比例性 4.抗原抗体反应的两个阶段 ①抗原抗体特异性结合阶段 ②可见反应阶段 * 1.高度特异性 抗原抗体反应物质基础是抗原表位(决定簇)与抗体分子超变区间的互补结合。