第七章 微生物药物的分离、精制和鉴别.ppt

为何要对发酵液进行预处理？ 目的：达到固液分离 对活性物质的浓缩 方法：化学萃取，树脂吸附，沉淀等 获得活性物质的纯品 方法：沉淀，吸附，结晶，脱色，色谱层析等。 操作时间应尽可能的短； 操作温度一般要低； 分离纯化操作应在药物性质许可的pH 范围内； 经常清洗消毒，避免杂菌的污染； 如果是注射用药物，精制和成品阶段应保证无菌操作。 红霉素的提取及精制 红霉素：碱性化合物，在碱性条件下溶于有机溶剂，在酸性时溶于水。 微生物药物的提取方法及其溶解性，微生 物药物本身的特异颜色，微生物药物对 酸、碱、温度、光线的稳定性等都可以作 为微生物药物鉴别用的一个“指纹”。 微生物药物的快速、准确鉴别 LC-UV（液相色谱-紫外光谱联用技术） LC-MS（液相色谱-质谱联用技术） LC-IR（液相色谱-红外联用技术） LC-NMR（液相色谱-核磁共振技术） 紫外光谱 红外光谱 核磁共振谱 质谱 三）离子交换树脂理化指标 合成树脂时单体中交联剂（如二乙烯苯）的含量百分数称为交联度。 通常8%-12%； 一般交联度越大，树脂越坚固，机械强度越好，在水中不易膨胀；交联度越低，树脂越柔软，越容易膨胀，越能很好地吸附较大的离子，达到交换平衡的速度越大；但机械强度差，吸附的选择性小； 1、交联度 2、膨胀度 树脂不溶于水，但亲水性强，具有亲水胶体性质，一般吸水膨胀，脱水收缩； 测定方法：将10-15ml风干树脂放入量筒，加入欲实验的溶剂（多为水），然后不时摇动，24h后，测定树脂的体积。前后体积之比称为膨胀系数； 膨胀系数与交联度有一定关系，交联度大的树脂膨胀系数小； 3、交换容量 指一定量树脂中可交换基团的毫克当量数，是表征树脂性能的重要指标。 若将树脂装柱进行操作，流出液中产物离子达到某一浓度时，操作即应停止，树脂进行再生后再使用。这一浓度称为漏出点。 在漏出点时树脂所吸附的量叫做工作交换容量。 四）离子交换工作原理 根据物质的酸碱性、极性不同，在水溶液中所带阴阳离子不同，电荷不同的物质对层析柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变洗脱液的离子强度或pH，不同物质就能依次从层析柱中分离出来。 在离子交换过程中，离子首先扩散到树脂表面，通过树脂扩散到交换位置，在交换位置进行离子交换。被交换的分子所带电荷越多，它与树脂的结合越紧密，也就越不容易被其它离子所取代。被交换的离子扩散到树脂表面，洗脱液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中。 大分子物质要选择交联度低些的树脂，小分子物质则选用交联度高的树脂； 由于交联度低树脂强度差、易破碎，因此，交联度选择的原则是在不影响交换容量的条件下，尽可能提高交联度。 五）离子交换树脂的选择 1、首先要考虑的是产物的酸碱性质 如强酸性物质应该选用弱碱性阴离子交换树脂，这主要是从是否容易解吸的角度考虑的；因为强碱性阴离子交换树脂固然也能吸附强酸性物质，但洗脱困难； 若产物为弱酸性物质则应选择强碱性阴离子交换树脂，如用弱碱性阴离子树脂则不易吸附。 同理，强碱性产物则应选用弱酸性阳离子交换树脂；弱碱性产物则选用强酸性阳离子交换树脂。 2、其次要考虑交联度 如：当产物分子是低价离子时，增加浓度有利于交换上柱；高价离子则在较低浓度下易被吸附。 六）操作条件的控制 1、交换条件控制 1）最重要的是控制交换时的pH 合适的pH应该考虑三方面： 应在被吸附物质稳定的pH范围内； 能够使被吸附物质离子化； 同时能使树脂离子化 2）在使用之前，树脂还必须处理成一定的型式 对于弱酸性和弱碱性树脂，为了使其能离子化，应采用钠型或氯型； 而强酸性或强碱性树脂可采用任何型式，但若产物在酸性或碱性条件下易破坏的，则不能采用氢型或羟型；对于偶极离子的有机物，应该采用氢型树脂。 3）要考虑到产物浓度对交换有影响 2、洗脱条件的控制 洗脱条件正好与上柱条件相反 如对pH范围的选择，若酸性上柱，则应在碱性条件下洗脱；若碱性上柱，就采用酸性条件洗脱； 7.1.3 精制（纯化） 分离提取的原则 第七章 微生物药物的分 离、精制和鉴别 7.1 提取的过程和原则 7.2 微生物药物的鉴别 pH2.5，滤液→醋酸丁酯 pH7.0，缓冲液 pH2.5，醋酸丁酯 丁酯提取液冷冻脱水，加入醋酸钾-乙醇溶液→青霉素钾盐结晶 反萃取 青霉素的提取及精制 青霉素：酸性化合物，酸性时为游离酸，易溶于有机溶剂。在pH7以上以盐状态存在，易溶于水。 erythromycin 发酵液预处理、过滤 将滤液pH调节到9.8-10.2，用醋酸丁酯提取 提取液用pH4.0-4.2的酸性缓冲液反提取 将pH调节到9.8-10.2，用醋酸丁酯二次提