第三章 植物基因工程载体及其构建.ppt

4、Ti质粒的改造 Ti质粒分子量过大，200kb左右，难以操作； 分布着各种限制酶的多个切点，难以找到可利用的单一限制性内切酶位点； T-DNA区Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，诱发肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生； Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（10％左右）拷贝数少； Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的序列。 野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍： 一元载体和双元载体 酶切连接系统 同源重组系统 Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合与切出反应。 创建Gateway克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway? LR Clonase?酶，产生表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。） Gateway?技术也利用了ccdB选择方法，以确保高效率的分离重组克隆。典型的效率是＞95％。 infusion重组系统 5、表达载体转化根癌农杆菌 感受态制备 CaCl2法：与大肠杆菌基本一致 区别：菌液需加入抗生素筛选； 培养时间更长； 培养温度28℃； 超低温保存用甘油。 转化 商业化T载体 一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72～75℃反应，进行末端的加T。 自制T载体 一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI，其识别和切割特点如下： TOPO技术 拓扑异构酶I在位点CCCTT切断并松弛超螺旋DNA，然后重新连接末端。这样，其同时作为限制酶和连接酶。 TOPO克隆是一种将拓扑异构酶与 T- 载体相结合的 PCR 产物快速克隆系统 pCR-TOPO ，无需 DNA 连接酶做连接。 3末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 Ⅰ ，当带 3 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口连接起来。 因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。 （2）平末端PCR产物载体 TOPO-Blunt载体 在 lacZ’基因的下游融合了一个 ccdB （Control of cell death）基因，该基因对大肠杆菌是致死的。 载体切成线状，再与目标 DNA 连接，转化大肠杆菌。 外源 DNA 片段与载体连接后，ccdB 基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。 如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。 TOPO克隆高效性原理 Topo连接反应有两个分子参与，而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。 10、质粒提取 细菌培养和富集 细胞悬浮 细胞破碎 细胞碎片基因组去除 蛋白去除 质粒收集 溶液1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl，10 mM EDTA，pH 8.0 溶液2：0.2 N NaOH ，1% SDS； 溶液3：3 M 醋酸钾 ，2 M 醋酸 苯酚、氯仿抽提 异丙醇/乙醇沉淀，70%乙醇清洗 具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制； 具备合适的酶切位点，供外源片段插入； 含有供选择转化子的标记基因； 适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备； 载体的安全性：对受体细胞无毒害，不能随便转移； 载体大小：原则上要求载体越小越好； 如果需要外源基因的表达：启动子。 载体应具备的条件 11、大肠杆菌感受态制备及转化 （1）热激法 挑选单菌落 过夜振荡培养 取1ml菌液+50ml培养基 2-3h，OD600=0.6 取1ml菌液+50ml培养基 2-3h，OD600=0.6 低温低速离心收集细胞 0.1MCaCl2悬浮处理细胞 2ml0.1MCaCl2悬浮细胞，分装，-80℃保存。 感受态细胞制备 转化 取出感受态 冰浴解冻 加入连接产物/质粒 冰浴30 min 42℃热激90 S 冰浴1 min 加入1 ml LB培养基培养45 min复苏 产物体系不超过1/10 收集菌体，涂板筛选，过夜培养 （2）电击法 当细菌长到对数中期； 冷却，离心； 然后用冷却的去离子水反复清洗； 最后用10%甘油重悬； 超低温保存。 感受态细胞制备 转化 受电场强度、电脉冲长度和DN