丁香园细胞融合经验.doc

[求助]我做了两次细胞融合,第一次融合后细胞全死了,第二次融合后细胞都没死,请问高手这是怎么回事?sp2/0用８氮鸟嘌呤筛时，８氮浓度是多少？对sp2/0密度要求是多少？感谢各位高手！1: 很简单如果HAT没有问题的话肯定是细胞没有融合好换句话说就是没有融合上,我也碰到过这种现象有时候想起来感觉有点不可能,只能再做一次才能说明问题.2: 融合前可将培养基内加入15μg/ml 8－氮鸟嘌呤筛选SP2/03: sp2/0密度大约2.5x100000即可.也可能是HAT失效了好高兴！得到您的指点！请问:１）您说的sp2/0密度的单位是什么哪？　　　　　我也做过用８－氮鸟嘌呤筛选，可是sp2/0老是长不好，老是长　　　　　不起来，所以就不用８－氮鸟嘌呤筛选了，直接用未筛的sp2/0　　　　　做融合．请问：２）您筛的时候，要用多长时间？融合前什么时候要换普通培养液培养？　　　３）您的sp2/0在筛的时候，长的如何？　　　大仙：可以具体的回答吗？　　　　　　作为生手，不胜感激！sp2/0密度？？融合前其应该处于对数生长期，sp2/0与脾细胞的比应该在 1：5至1：10之间，８－杂氮鸟嘌呤筛选周期是一周，不筛选不能进行融合。筛选完之后应该2次换液。sp2/0在筛的时候可能会长的稍慢一点儿，其他的和普通培养基培养没有区别。还有HAT筛选大概是14天，中间第十天视生长情况补加HAT培养基（细胞生长过多，培养基变黄）。 请问:融合时,96孔板每孔要加多少细胞?加多或加少了,会不会影响HAT筛选?最后的细胞浓度大约是2.5x1000000,我的每一个孔都加100μl.融合后大约7-8天改换HT培养,大约14天后就可以筛选了.GOOD LUCK!!!求助：在做单抗前，SP2/0细胞是否需要筛选一下。如果需要筛选的话，筛选的方法是怎样的呢？还有我的细胞大小不均，有时我发现个别瓶的细胞长的普遍小，不知原因出在了哪？因为是第一次接触这方面的实验，还请高手指教，不胜感激！由于骨髓瘤细胞和在培养过程中会有一定的突变率，可以呈现“返祖”现象，极少数细胞变回到HGPRT+，重新表达HGPRT酶，因而对HAT培养液不敏感，使得融合结果表现出高效率的假象。因此刚复苏的SP2/0应置于含8－AG（8－氨氮鸟嘌呤）20цg/ml培养液中培养一周，再转入完全培养基培养1－2周即可用于融合。8－氨氮鸟嘌呤一般试剂公司都有如SigmaSP2/0可用8-氮鸟嘌呤20ug/ml筛选,但也可不用,一般细胞很稳定,不会出现HGPRT+,不影响融合筛选.细胞大小有时与细胞浓度和培养瓶表面积有关,浓度大、面积小时一般细胞偏小。若同一瓶细胞大小不匀，可能是有细胞死亡现象，应胎盘蓝染色查看细胞活率，改善培养条件。如题，今天看复苏的细胞，有一些已经委缩，还有一些透亮，比较大，但发现培养基没加青链霉素，不知有没有影响？还有我的细胞情况正常吗？一般sp2/0复苏几天能正常的培养？请各位战友不吝赐教，我复苏这个细胞已经很多次了，情况不好，实验缓慢，心情郁闷。细胞复苏的状态和细胞、冻存的状态、冻存复苏技术都有关。对于青链霉素，我已经有年头不用了，个人习惯，你可以问问园子里的其它同志，可能有一些人也这样。对细胞培养没有如何影像。唯一的影像是如果污染的话，你会更快的发现（玩笑）。其实没有用的，试试吧。对细胞不会有影响，sp2/0细胞比较好养，如果你复苏后细胞状态不是很好，可能有一些细胞悬浮在培养液中，这个并不要紧，可能是你，冻存过程中冻存的方法有一些问题，也可能向上面的哥们说的，冻存的时候细胞状态就不好，这个狠重要，如果你的培养条件都比较好的（培养基，培养箱等都没问题），你就少量的换下液，或是在培养瓶中加一些饲养细胞，主要是为了取出。死的细胞，有一些大的sp2、0细胞这个没多大影响，如果你要是做细胞融合，你就把这些细胞重新克隆一下，取几个生长较快。的和一下状态较好的细胞，重新扩大培养，这样你的细胞生长就均一了。一个原则就是细胞不要经常的处理，能不动就不要动，传代，或是其他的处理都会影响细胞状态，一般复苏一个星期。细胞就会有一个好的状态，当然有的也会时间长一些，耐心些，一旦细胞状态好了，它的繁殖速度是十分的快的。我这有这个细胞培养的照片，你可以看看它的密度。祝你有好的运气 楼上的，你的细胞多常时间传一次？我的密度比你的大多了，基本上24小时传一代，这个正常吗？至于抗生素，我没有加过。如果污染了就重养了。请问楼上的：如果你要是做细胞融合，你就把这些细胞重新克隆一下，取几个生长较快。的和一下状态较好的细胞，重新扩大培养，这样你的细胞生长就均一了。怎么重新克隆？是不是加8氮鸟嘌呤？SP 2/0 生长很快，半悬浮生长，换液的时候，全部倒掉的话（只留贴壁的），24小时换液