第五章.分子生物学的研究方法-电泳、杂交.ppt

第五章 分子生物学研究的主要方法 序：重组DNA技术回顾 重组DNA技术的定义及步骤 2.克隆（clone): 重组DNA技术的一般步骤 第一节 DNA基本操作技术——一、 DNA提取分离 二、核酸的凝胶电泳 1 原理 2 琼脂糖凝胶电泳 不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力 电泳槽结构 电泳装置 指示剂 溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 红色荧光 溴化乙锭染色 银染 LMP琼脂糖回收DNA分子 变性胶电泳 3 脉冲电场凝胶电泳 “电泳”思考题 三、 核酸分子杂交 1 Southern blot Southern blot原理模式 Southern blot转移装置图 探针制备及标记 DNA聚合酶法制备探针 随机引物法制备探针 2 Northern blot 3 Western blot 4 原位杂交：菌落杂交和空斑杂交 5 斑点杂交 思考题 1.Southern DNA印迹杂交 2.Northern RNA印迹杂交 3.Western印迹杂交 4.菌落(或噬菌斑)杂交 5.斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 返回第二章 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E．Southern于1975年首先设计出来的，故又叫做Southern DNA印迹转移技术。 变性胶电泳 × 转膜 放射性探针杂交 放射自显影 回收DNA 漂洗 探针 -单链探针： 末端标记 Klenow:标记3’端，补平和置换反应 T4 polymerase:标记3’端 3’-5’外切活性强，特别适用于3’突出末端 Kinase:标记5’端 正反应 32P-ADP + 5’-OHNNNN→5’P NNNN 交换反应：过量32P-ADP+5’-p NNNN→5’32P NNNN →5’ 末端转移酶标记3’ DNA片段，Oligo,随机DNA ssDNA模板，通用引物，合成ssDNA探针 RNA探针，RNA polymerase 1）. 生物素标记核酸探针 Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。 2）. 地高辛（Dig）标记核酸探针 非放射性标记探针 类似于Southern blot,但用于检测RNA的分子杂交技术，用于分析总RNA或mRNA ? 电泳缓冲液 甲醛buf(5×) 0.1mM MOPS(Ph 2.0) (3-(N-玛琳代)丙磺酸) 40 mM NaAc 5mM EDTA(pH 8.0) DEPC H2O 制胶 甲醇（MW 30.03）通常为37%水溶液，12.3M(pH4.0) 终浓度，1×buf + 2.2M甲醇 上 样 预处理 RNA （up to 30μg）4.5μl+5×buf 2.0μl 甲醛 3.5 μl 甲酰胺 10 μl 65℃ 15min loading buf 50%甘油，1mM EDTA（pH 8.0） 0.25% BPB 0.255 二甲苯 TFF ? 电 泳 loading之前，预电泳5min 5V/cm 电泳1-2hr之后，混合正负极电泳液 转 膜 预处理 DEPC H2O洗涤去除甲醛 如果胶浓度10% 或 厚度0.5cm 或 底物2.5kb，需用0.05M NaOH处理20min，部分水解RNA 无RNase H2O洗涤，20×SSC浸泡45min 转移，同Southern 返回第二节 基本原理同其它blot方式，用于检测蛋白质，与Southern的关键区别在于探针性质：抗体? 抗体的要求： 单克隆抗体 但并非都合适，由于靶蛋白已变性 多克隆抗体 抗体为混合物，对其特异性，亲和力及浓度都一无所知，对由SDS/还原剂变性处理的目标蛋白是否还能识别应做预备实验 * 分子生物学 西北师大 生科院 * 分子生物学研究方法 西北师大 生科院 * 分子生物学研究方法