组织培养基本技术.ppt

第三章细胞培养的基本技术 基本操作技术和要求 培养室的无菌操作： 培养前准备： 培养室和超净台的消毒： 洗手和着装： 无菌培养操作： 第一节培养细胞的取材与分离 一、培养细胞的取材： 1、原代取材的基本要求： 无菌取材 取材器械要锋利 及时培养 剔除与培养细胞无关的成分 营养要丰富 采用易培养的组织进行培养 注意保存原代组织的相关材料及信息 2、取材的基本器材和用品 眼科组织弯剪、弯镊、手术刀 装有无血清培养基或Hank’s液的小瓶 小烧杯、培养皿 3、不同组织的取材 ①皮肤和粘膜的取材 取材目的：获取上皮细胞（主），成纤维细胞 取材方法：手术过程切除的部分组织；如有特殊需要可单独取材（2～3mm2） 注意事项：严格消毒；不用碘酒消毒；要获取上皮细胞，取材时不要切取太厚，如欲培养成纤维细胞则反之。 ②内脏和实体瘤的取材 取材目的：获取各脏器细胞及瘤细胞 取材方法：明确和熟悉所需的组织类型和部位，去除不需要的部分如血管、神经和结缔组织；尽可能取肿瘤细胞分布较多的部分，避开坏死液化部分。 注意事项： ③血细胞的取材 取材目的：白细胞----用于染色体分析、淋巴细胞体外激活进行免疫治疗等。 取材方法：静脉取血（微量时，指尖或耳垂） 注意事项： 加入肝素抗凝（量适宜，过大导致溶血） 抽血要严格无菌。 ④鼠胚组织的取材 取材目的：取材方便，易于培养，与人类相近，是较常用的培养材料。 取材方法：断颈处死，75%酒精消毒5min，固定，解剖取材 注意事项： 保证无菌消毒 浸入75%酒精时间不能太长，以免酒精入口 消毒后的操作应在超净台或无菌环境中进行 ⑤鸡胚组织取材 取材目的：用于分离培养禽类病毒以进行疫苗的生产 取材方法：选用9～12d的鸡胚，无菌条件下剪开气室端蛋壳，切开蛋膜，用小镊子挑起鸡胚，放到无菌培养皿中取材。 注意事项：在无菌条件下操作。 二、组织材料的分离 目前分散组织的方法有机械法和化学法两种。 1、细胞悬液的分离方法： 培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，500～1000r/min低速离心5～10min。 2、组织块的分离方法： 机械分散法：对一些纤维成分很少的组织，如脑组织、部分胚胎组织以及一些肿瘤组织。 剪切分离法：组织块移植培养。 消化分离法：获得细胞悬液直接培养。 ①机械分散法的步骤： 先用Hank’s液或无血清培养液漂洗组织，剪成5～10mm3的小块，置80目孔径的筛网，用注射器针芯轻压组织，使之压碎并通过纱网。 吸管吸出组织悬液，置150目筛中，步骤同上。 镜检计数，接种。（组织过大，用400目筛）。 ②剪切分离法的步骤： 冲洗的组织块放在小烧杯中，用眼科剪反复剪至糊状。 加入Hank’s液或无血清培养液，反复轻轻吹打。 低速离心去上清液，剩下组织小块即可培养。 ③消化分离法 消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分散的方法。 消化后组织松散、细胞分开，细胞容易生长，成活率高。 常用的方法： 胰蛋白酶消化法 胶原酶消化法 A、胰蛋白酶消化法：细胞间质少的软组织 组织剪成1～2mm3的小块或糊状，吸到三角烧瓶或培养瓶， 加入预温到37℃的胰蛋白酶。（也可在4℃冰箱中冷消化12～24h）， 放入37℃水浴或温箱中20～60min。消化好后用Hanks液漂洗，去除胰蛋白酶， 用培养液重悬细胞，计数、接种。 B、胶原酶消化法： 将漂洗修剪干净的组织剪成1～2mm3的小块，放到三角烧瓶， 加入3～5倍体积的胶原酶，密封烧瓶， 放入37℃水浴或温箱（恒温振荡水浴箱）中4～48h， 收集消化液，1000r/min离心5min，弃上清液， 用培养液重悬细胞，计数、接种。 第二节原代培养技术 原代培养 概念：是从供体取得组织细胞后在体内进行的首次培养。 原代培养是建立各种细胞系的第一步，是培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。 原代培养的细胞生物学特性未发生很大变化，适合做药物测试、细胞分化等实验研究。 原代培养的方法： 组织块培养法 消化培养法 一、组织块培养法 概念：是将组织剪切成小块后，接种于培养瓶进行培养。（组织量少的原代培养） 特点：简便易行，成功率较高。 操作： 取材修剪冲洗剪切成1mm3小块； 移入培养瓶； 分布组织小块间距5mm； 翻转培养瓶并加培养液37℃静置2～4h； 翻正培养瓶进行培养； 观察原代细胞生长。 二、消化培养法 概念：组织通过消化分散法制成细胞悬液，接种、培养。（适合培养大量组织） 优点：较短时间可获得大量活细胞。 缺点：步骤多，易污染，成本高。 操作： 按消化分离法获取细胞； 镜下观察见组织已分散，终止消化； 200目筛网滤过组织块； 收集的消化液800～1000r/min离心5min； 去上清，加含血清培养基制成细胞悬液； 计数，接种于培养瓶。 动物细胞培