细胞凋亡检测技术...ppt

细胞凋亡及检测技术 第一节　概 述 一、细胞凋亡的概念 　　　细胞凋亡(apoptosis〉，这是1972年Kerr等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体(apoptotic bodies〉，而被其他细胞吞噬。“凋亡”一词来自希腊语，apo意为“分离”，ptosis指花瓣或树叶的脱落，“凋亡”是由这两个词组合而成，意指细胞凋亡的形态类似秋天花瓣或树叶的凋落一样。 二、研究简史 　　半个世纪前:人们就观察到在生物的发生、生长、发育以及衰老过程中，一直伴随着组织细胞的生理自发退化死亡现象. 　　1965年:发育生物学家Lockshin和Williams首先提出了PCD（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程，认为随着成年蛾的出现，其幼虫死亡是一种发育调节性死亡。 1972年:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念，从形态学角度描述细胞的生理死亡，并认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学现象，可能具有十分重要的生物学意义。　　1977年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。并认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学现象，可能具有十分重要的生物学意义。 1980年:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等。　1989年: 0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中，发现T细胞受体(TCR)与自身抗原相互作用与未成熟T细胞的PCD发生有关，并在体外证实剌激CD3分子可诱导未成熟T细胞PCD的发生。证明了信号传递物质对PCD的调控作用。 1991年:Ellis首先发现了线虫(C.elegans)体内Ced-3、4两个基因与PCD的发生密切相关，随后逐渐发现了多种参与PCD的正相调节基因和负相调节基因，前者包括Ced-2、p53、c‐myc、Fas、糖皮质激素受体及白细胞介素1β转化(ICE〉等基因，后者则有Ced-9、bcl-2、p53等基因. 三、细胞凋亡的特征 细胞凋亡与细胞坏死虽然都是细胞死亡，但细胞凋亡的形态及生化特征与坏死性细胞死亡的特点则不同 细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别 细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别 四、细胞凋亡的过程与调控 （二）细胞凋亡的调控 （2）抑制性因素： 2 .细胞凋亡信号转导 研究较多的系统： 2．cAMP/PKA信号系统（cAMP为第二信使） 3．Fas蛋白/Fas配体信号系统 4．神经酰胺信号系统 第二节 细胞凋亡的检测方法 细胞凋亡检测方法：归纳起来，可分三方面，即根据凋亡的形态学特征、细胞凋亡的生化特征以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。本节主要介绍细胞凋亡的常用病理学检测方法。 一、苏木精-伊红染色方法(HE染色) 1．石蜡组织切片HE染色（略） 2．细胞爬片或细胞涂片的HE染色 （1）细胞爬片或细胞涂片的制备： 贴壁生长细胞(包括肿瘤细胞)：让细胞生长在盖玻片使其在上面爬行生长。取出盖玻片，经PBS轻轻漂洗后，用4%的甲醛或多聚甲醛在常温下固定5－10min，即可染色。 悬浮生长细胞(包括肿瘤细胞)或贴壁生长的细胞经消化脱壁成单细胞悬液后，可经细胞涂片后染色。 （2）染色方法:同石蜡组织切片HE染色，免去第1和第2步。 【结果判断】 1.光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等。 2.在细胞爬片上，凋亡的细胞变圆、变小，可见细胞核固缩、碎裂，染色体被染成深蓝色或蓝黑色；可见细胞膜皱折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体(apoptotic bodies〉。而正常细胞经染色后仍保持细胞原有的生长形状(如梭形或多角形)，细胞核规整，染成均一蓝色。细胞涂片时可见凋亡细胞核固缩、碎裂，染色变深；正常细胞染色体显均匀淡蓝色或蓝色，而坏死细胞细胞肿胀，可见细胞膜的连续性破坏，核染色体染成很淡的蓝色甚至消失。 二、甲基绿-派诺宁染色法 【染色原理】 细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态，但两者发生机制不同。细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。而细胞坏死则是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA的损失。根据这一特点，可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。 【试剂及配