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第 二 章 荧 光 分 析 法Fluorometry 引 言（定 义 、 特 点 、分 类） 荧光（fluorescence)是一种光致发光现象。 荧光分析是利用荧光物质的特征荧光光谱和其荧光强度与浓度的线性关系进行定性和定量分析的一种光学分析方法。 根据荧光物质的激发光波长范围不同分有： 可见荧光、紫外荧光、红外荧光 荧光分析的特点： 1.灵敏度高，10-9 g/ml 2.选择性强，具有激发和发射两个特征光谱。 3.样品用量少 4.方便、快速 缺点：样品的应用范围不广，干扰因素较多。 第 一 节 荧 光 分 析 的 原 理 一 、 荧 光 的 发 光 机 理 物质受激发光照射后，发射出较激发光波长为长的发射光，当激发光停止后， 发射光持续时间约为10-8秒 荧光 发射光持续时间约为10-4 ～ 1秒以上 磷光 荧光的激发与发射 基态 激发单重态 S * 激发三重态T* 、 二、激发光谱和荧光光谱 激发光谱：（excitation) 改变激发光波长测定在荧光最强波长处荧光强度的变化。 荧光光谱：（emission) 保持激发光波长和强度不变，测定不同荧光波长处荧光强度的变化。 荧光光谱的特点： 荧光波长比激发光波长长。 荧光光谱不受激发光波长的影响。 三、荧光强度和荧光物质浓度的关系 第 二 节 荧 光 分 析 的 方 法 一、荧光定性分析 根据标准荧光物质的激发光谱和荧光光谱进行比较分析。 利用专有的荧光反应进行鉴别 二、荧 光 定 量 分 析 1.直接比较法 Fx – F’r r 空白 Cx = -------- Cs s 标准 Fs – F’r x 样品 2.工作曲线法 三、影 响 荧 光 分 析 的 因 素 1.物质分子结构的影响 具有共轭体系的发色团、刚性平面和多环结构的分子，具有较强的光吸收能力。 2.取代基的影响 斥电子基团可使荧光强度增加 如：-NH2, -OH等 吸电子基团常使荧光强度下降 如：-COOH,-NO2等 3.环境的影响 温度 、 pH、激发光、溶剂 样品浓度(自熄灭，自吸收)、干扰物质（内滤作用） 散射光：瑞利散射(Rayleigh scattering) 不产生能量转换 拉蔓光（Ramman) 产生能量转换 第 三 节 荧 光 分 析 的 仪 器 一、荧 光 光 度 计 采用滤色片来获取激发和荧光测定波长。 主要用于定量分析。 二、荧 光 分 光 光 度 计 采用两套分光系统来分别获取激发和荧光测定波长。 主要用于定量和定性分析。 第 四 节 荧 光 分 析 的 应 用 一、直 接 荧 光 法 色氨基 Trp 酪氨基 Tyr λ激发=279 λ发射=348 λ激发= 278 λ发射= 310 二、外 源 荧 光 法 三、间 接 荧 光 法 多重荧光分析技术CyDyeTM DIGE 荧光标记物 分子量一致，都带一个正电荷。 最小化标记，不改变蛋白质的 pI。 蛋白质组学技术平台 理想情况下，内标中最好含有来源于所有样本的每一个蛋白质。最好的办法就是将所有的样本等量混合来形成内标。 Experimental design: 2-D DIGE Experimental design: 1 colour 2-D * * π→π* n →π* n →π* M = 2S + 1 S = 0, M = 1 S = 1, M = 3 π * n π π * n π π * n π π * n π 荧光效率 φF = 发射的光量子数 吸收的光量子数 φF ≤1 A0.05 IF=2.303φFI0εlc IF=Kc Ex=340-360nm Em=455nm Blue Fluorescence 488 nm Green Fluorescence 532 nm Red Fluorescence 633 nm 差异凝胶电泳工作平台 （difference gel electrophoresis，DIGE） 内标为实验中的每张胶上的每个蛋白质都提供了一个参考点。 报告基因 生物发光 荧虫酶（Lucif