蛋白质——理化性质.ppt

蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大 pI通常在 6.0 左右 蛋白质两性解离性质和等电点 每个蛋白质都有特定的等电点，与所含氨基酸的种类和数量决定． 所含碱性氨基酸多，PI偏碱；所含酸性氨基酸多， PI偏酸；两者相等， PI中性偏酸． 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳 在一个特定的ＰＨ值中，各种蛋白质等电点不同，所带电荷性质和数量也不同，分子质量和颗粒大小不同，因此它们在电场中移动的方向和速度也不同，能彼此分开． 电泳方法： 1、电泳和等电聚焦法： 普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳 从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。 从支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等） 电泳技术分类 (二). 蛋白质的沉淀作用 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 ? 选择性沉淀蛋白质的方法 ①盐析法:在蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl]，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。 分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的血浆球蛋白,而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的血浆清蛋白。因此,使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进行初步分离。 ②有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数，增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒凝聚沉淀。PEG、丙酮、乙醇等 ③重金属盐沉淀：pH＞pI时带负电荷，与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 　　　生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。 　　　酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀。 ⑥等电点沉淀法。 (三)、蛋白质变性与复性 核糖核酸酶变性与复性作用 1. 双缩脲反应 2. 米伦氏反应—酪氨酸的特有反应 3. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应 4. 坂口反应—精氨酸特有的反应 5. 福林酚试剂反应 6. 茚三酮反应 7. 黄色反应--芳香族氨基酸的特有反应 8. 考马斯亮蓝G250 分离纯化的意义 ①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义； ②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂； 　（如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等） ③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病； ④基因工程的需要。 分离纯化的要求 1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究其一级结构和空间结构的蛋白、一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失，而且提纯步骤越多，损失越大。 生物大分子的制备有以下主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵生物大分子含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 生物大分子分离纯化的一般步骤和原则 注意事项 基本原则：防止生物分子变性、降解 1．控制适当的pH 2．控制低温 3．注意提取过程中的溶液环境 4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚 基 分离纯化的前处理 (1)、材料的选择与预处理 选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。 实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理，若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。 （2）、细胞的破碎 分离提取某一生物大分子