DGGE和TGGE的操作步骤.pdf

实验四 变性梯度凝胶电泳（DGGE ）和温度梯度凝胶电泳（TGGE ） 一、实验原理 变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE ）最初是Lerman 等人 于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变 (20, 42, 52, 53) 。 Muyzer 等人在 1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 (50) 。后来又发展出其衍生技 术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis ，TGGE ） (49) 。此后十年间， 该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结 构的主要分子生物学方法之一 (49, 51) 。 1．原理 双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。 不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因 此不能被区分。DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和 甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。 一个特定的 DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) (20, 42) 。一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几 个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成（图 1）。当温度逐渐升高（或是变性 剂浓度逐渐增加）达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当 温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高 的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA 完全解链。（图1 显示的 是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域，横坐标是该DNA 片段的序列，依次从第一个碱 基到第234 个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。MD1 是解链温度 最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个解链区域。） MD3 MD2 MD1 图1：DNA片段解链区域示意图 不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温 度也是不一样的。当它们进行 DGGE/TGGE 时，一开始温度（或变性剂浓度）比较小，不 能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰 胺凝胶中一样。然而一旦DNA 片段迁移到一特定位置，其温度（或变性剂浓度）刚好能使 双链DNA 片段最低的解链区域解链时，双链DNA 片段最低的解链区域立即发生解链。部 分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，同样长度但序列不同的DNA 片 段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处 发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。 然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到 DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段 会完全解链，成为单链DNA 分子，此时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA 片 段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在DNA 片段的一端 加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。含有 GC 夹子的DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以 防止DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每 个碱基处的序列差异都能被区分开 (52, 53) 。 当用 DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合 PCR （polymerase chain reaction ）扩增技术，用PCR 扩增的16S rRNA 产物来反映微生物群落结构组成。通常根据 16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的5’-端含有一段GC 夹 子，用来扩增微生