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实验十一 酶联免疫吸附测定（ELISA ） 一、原理 酶联免疫吸附法(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)是一种利用免疫学原理检 测抗原或抗体的技术。它与经典的以同位素标记为基础的液—液抗原—抗体反应体系不同之 处是建立了固—液抗原—抗体反应体系，并采用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反应来检 测。由于酶反应的放大作用，使测定的灵敏度极高，可检出 1pa 的目的物；同时酶反应还具 有很强的特异性。除了可溶性抗原(抗体)之外，ELISA 还可以检测含表面抗原的细胞。因此， ELISA 是基因表达研究中不可缺少的方法。通过表达蛋白的定量测定，可以研究外源基因 在转基因植株中的表达活性、外源基因在转基因植株中表达的器官组织特异性和外源基因在 转基因植物中的表达调控。 ELISA 检测程序包括抗体制备、抗体或抗原的包被、免疫反应及检出三个阶段，现将 这三个阶段的有关原理及操作介绍如下： （一）抗体的制备 抗体是机体应抗原刺激产生的一组特殊的球蛋白，以 I ｇ表示。无脊椎动物不产生免疫 球蛋白；两栖类产生 IgM 、IgG ；家兔产生IgM 、IgG、IgA ；人类出现IgG 、IgM 、IgA、IgD 、 IgE ，其中 IgG 是主要的，占总量的 75 ％，分子量为 160kDa。ELISA 检测中涉及到的抗体 有两种，一种是未标记的抗体，另一种是酶标记的抗体。酶标记的抗体又有两种情况，第一 种是针对特异抗原的酶标一抗，第二种是针对一抗的酶标二抗。酶标抗体制备包括通过免疫 过程制备抗体及对所获的抗体进行酶标记两大步骤。 1．通过免疫反应制备抗体 1)抗原制剂的制备 要获得优质抗体，使用的抗原必须具有较强的免疫原性并应经过 纯化。完全抗原具免疫原性(刺激机体产生一系列免疫反应)及反应原性(与抗体发生特异性反 应) 。如果只有反应原性而缺少免疫原性或免疫原性不完善，则称不完全抗原或半抗原。需 要用半抗原进行免疫反应时，应将半抗原与一些免疫原性强的蛋白质，如 BSA 、γ—球蛋白 等(这些蛋白质称为载体蛋白)进行化学偶联，或通过戊二醛作用使二者交联形成多聚体，这 样均可提高其免疫原性。免疫时，需将抗原制备成抗原制剂。制备抗原制剂常使用免疫佐剂。 可溶性抗原经佐剂乳化后注射，佐剂—抗原的乳化物在动物机体内逐步释放，可延长抗原在 机体内的存留时间，便于抗原在较长时间里不间断地刺激机体免疫系统，提高抗体效价。另 外佐剂中含有激活巨噬细胞等生理活性的卡介苗类物质，可提高抗原的免疫原性。常用的佐 剂是福氏佐剂，成分是 1 份羊毛脂+5 份石腊油混合后加入 3-4 mg ／m1 的卡介苗，此为完全 福氏佐剂，不加入卡介苗的为不完全福氏佐剂。 2)免疫反应 抗体是通过免疫反应产生的。免疫反应是机体在抗原刺激下产生的体液 免疫(体液抗体)和细胞免疫(效应淋巴细胞) 的过程。这一过程依赖于抗原的特定的化学结构 (抗原决定簇)及动物机体的免疫反应能力(抗原免疫原性) 。动物机体免疫反应能力除受遗传 因素控制外，还与机体的生理状态、抗原进入机体的途径、佐剂的使用等因素有关，因此制 备抗体时这些因素都应在考虑之内。同一抗原对不同种动物、同种但不同品系的动物、甚至 不同的个体，产生特异免疫反应的强弱都可能不同。因此，必须选择对该抗原敏感的动物进 行免疫。最常用的动物是家兔，此外还有山羊、鼠、鸡、马等。 抗体的产生需要一个过程。第一次免疫时产生抗体的水平低，并不持久，其主要成分是 IgM ，需进行再次免疫。当抗原第二次进入体内时，体内的抗体迅速与抗原结合，因而在开 始时体内抗体水平下降，一两天后抗体水平又显著上升，并在短时内达到高峰。该高峰水平 高于第一次免疫，此抗体水平可维持数月，其主要成分是 IgG 。如再注射一次，抗体水平可 再提高，直到不能再继续增高为止。此做法称为加强免疫。注意，要获得最大的免疫反应， 第一次和第二次抗原注射之间的时间间隔不能太短，一般在 3～6 周。 免疫途径有耳静脉、淋巴结、肌肉、皮下、皮内等注射。最简单而且也是最常用的是多 点注射：将抗原—佐剂的混合液注射到动物皮内或皮下的多个位点内，其优点是第一次免疫 反应快，抗体效价高，需要加强免疫的次数少。 3)抗血清制备 抗血清是指含有某种特异抗体的动物血清。在加强免疫 7～10d 后可从 耳缘静脉或直接穿刺心脏取血，静置，离心，上层血清即为抗血清。由于抗原与抗