PacBio原例及应用.pdf

PacBio 的原理及应用 主要内容 1. PacBio RS II系统简介 2. 技术原理 3. 数据特点 4. PacBio技术应用 PacBio RS II 特征： Single Molecule 单分子测序，直接观测单个DNA 聚合酶聚合过程，无需PCR扩增， 无碱基偏向性，对GC含量不敏感 Real-Time 相对于二代，没有洗脱的过程， 实时观测DNA聚合过程 长读长 读长可以达到几十K 高错误率 错误率高达15% PacBio RS测序系统（SMRT DNA Sequencing System ），是由美国Pacific Biosciences公司研发 的第三代测序系统。 / PacBio RS II Workflow 从模板制备到完成初级分析10 hours，其中需要手动操作的 时间4 hours 技术原理 文库制备（约3~6 hours ） SMRTbell Templates 技术原理 相当于NGS的Lane 合成反应在ZMW 中进行，每 DNA聚合酶的活 每个run可以测1~16 个SMRT Cell上约有15万个 性直接影响测序 个SMRT Cell ZMW，在测序过程中，大约 读长 有1/3处于活跃状态 技术原理 DNA聚合酶 4色荧光标记4种碱基 读长主要与聚合酶的活性保持有关，而酶 的活性主要激光对它的损伤的影响 PacBio还在不断优化聚合酶的性能，比如给 聚合酶加上免受激光影响的保护碱基等，进 一步提高读长，提高测序质量和通量 技术原理 ZMW （Zero-Mode Waveguides）零模波导孔 DNA聚合酶结合在ZMW底部，合成反应在孔 中进行， ZMW 的外径大约100多nm，而检测激光的波 长为几百nm，激光从底部打上去后不能穿透小 孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围 （体积20e-21L ）里，正好足够覆盖需要检测的 部分，使得信号仅来自于这个小反应区域，孔 外过多的游离核苷酸单体依然留在黑暗中，将 背景降到最低 进入孔中的碱基，只有参加合成反应的碱基 的光信号可以保持一段相对较长的时间，从而 被识别 技术原理 荧光标记位点 NGS PacBio 标记位置 5’端甲基 3’端磷酸键 新的碱基加入时，在3’端磷酸键 在合成过程中，荧光标记物的一 的标记会随磷酸键断裂自动被打 部分保留在DNA链上，随DNA链 断，标记物被弃去，即合成的 特点 的延伸会产生三维空间阻力，导