不同长度茎部shRNA表达载体构建和鉴定.PDFVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, March 25; 26(3): 386–392 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2010 CJB, All rights reserved. 生物技术与方法 不同长度茎部shRNA 表达载体构建与鉴定 1 2 2 2 1 2 刘中华 ，乔宪凤 ，肖红卫 ，刘西梅 ，王华岩 ，郑新民 1 西北农林科技大学动物医学院 陕西省干细胞工程技术研究中心 陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100 2 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064 摘 要: 本研究针对同一目的基因设计构建不同茎部长度的shRNA 表达载体，并对其在细胞及胚胎水平的干扰效应做 一比较。以绿色荧光蛋白基因为沉默效应的靶基因，设计茎部长度分别为21 bp 、27 bp 、29 bp 的干扰片段，退火后连 入带有H6 启动子的真核表达载体psiSTRIKE 中 (分别命名为EGFP-21 siRNA 、EGFP-27 siRNA 和EGFP-29 siRNA) ， 将构建成功的载体以脂质体法转染小鼠胚胎成纤维细胞，利用荧光定量PCR 对其荧光表达进行精确定量。不同茎部长 度的 shRNA 载体均使绿色荧光蛋白基因表达降低，茎部为29 bp 时比21 bp 、27 bp 表现出更明显的沉默效应。细胞水 平沉默效应的初步验证，为筛选适合小鼠个体水平的最佳发夹结构奠定了基础。 关键词: 基因沉默，shRNA ，绿色荧光蛋白，小鼠，荧光定量PCR Construction and identification of different stem shRNA expression vectors 1 2 2 2 1 2 Zhonghua Liu , Xianfeng Qiao , Hongwei Xiao , Ximei Liu , Huayan Wang , and Xinmin Zheng 1 Shaanxi Stem Cell Engineering and Technology Research Center, Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, College of Veterinary Medicine, Northwest A F University, Yangling 712100, China 2 Institute of Veterinary and Animal Science , Hubei Academy of Agriculture Science, Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Molecular Breeding, Wuhan 430064, China Abstract: We constructed shRNA vectors with different stem length, and tested the silencing effectiveness in mouse cells and embryos. We designed interfering RNAs with stems of 21 bp, 27 bp, and 29 bp. The enhanced green fluorescent protein gene was used as target gene. The synthe