Solexa-测序技术原理介绍_20120715.pdf

测序技术原理及流程 北京百迈客生物科技有限公司 Why Sequencing ？ • 认识DNA序列 • 从根源上寻找导致蛋白功能差别的位点 • 为物种鉴定、临床诊断和司法鉴定提供基 础 • 疾病预测 • 研究基因间的相互作用 • 揭示物种进化的历程 • 生命之树 一代 测序 二代 测序 DNA 测序需要解决的基本问题 • 如何读到DNA 片段的碱基信号？ –通过扩增来增加DNA 的数量来放大信号 –有足够多的DNA 合成反应中止于同一个碱基 • 如何读到DNA 片段的连续碱基信号？ –让合成反应的中止依次出现在每个碱基上 • 如何读到一批DNA 片段的连续碱基信号？ –在不同模板的反应间建立有效的隔离方式 Contents • Sanger 测序技术原理 • Solexa （Illumina GA/HiSeq）测序技术原理 • 454 测序技术原理 • SOLiD 测序技术原理 • 四种测序方法比较 the first-generation sequencing technology Sanger法测序原理 Sanger测序技术 PCR 末端终止技术+ 电泳检测技术 单个片段序列测定 最高通量：小于4MB/天 基于平板胶的测序技术 96通道毛细管阵列 双脱氧终止法测序反应原理 • 原理： –原料：DNA 聚合酶、DNA模板、单链寡核苷酸引物、 4种dNTP及4种ddNTP 的测序反应体系 脱氧核苷酸和双脱氧核苷酸 双脱氧终止法测序反应原理 • 测序过程： –DNA 聚合酶在模板链指导下，不断地逐个将dNTP加到引 物的3’-OH 末端，使引物延伸，合成出新的与模板互补的 DNA链。 –在链的延长过程中一旦加入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）， 由于其双脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，不能同后续 的dNTP形成磷酸二酯键，链终止延伸。形成一系列具有相 同5’- 引物端和以ddNTP残基为3’端结尾的长短不一的片 段的混合物，通过毛细管电泳，并经过分析从而获得模板 DNA 的核苷酸序列。 Sanger 法的特点 • 原始输出是峰图文件，可以看出信号的细微变化 • 通量小 • 单个目标序列的处理灵活性强 • 系统稳定，操作简便 • 单个测序长度长，能达到上K • 反应单元是一个充满溶液的容器 （96孔板或384孔 板的一个孔），这是局限了通量的根本 Next-generation sequencing technology Solexa测序原理及流程介绍 solexa测序技术原理 Solexa 是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By- Synthesis ，SBS) 的新型测序方法。通过利用单分子阵列实 现在小型芯片(Flow Cell)上进行PCR反应。 新的可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记 荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光， 从而读取碱基信息。 Solexa Sequencing Technology 3’ 5’ DNA (0.1-1.0 ug) A G