核酸的分离纯化技术-生物学试验教学中心.doc

第一章 核酸的分离纯化技术 一、原理和用途 用EDTA络合二价离子，SDS结合膜蛋白，溶菌酶破坏膜结构，使DNA出到膜外，经氯仿异戊醇沉淀蛋白，可获得较纯的DNA。用于克隆细菌染色体上的目的基因、细菌污染检测，绘制基因图谱等。 LB液体培养基 3.0 g 酵母浸出粉 1.5 g 氯化钠 3.0 g 葡萄糖 0.6 g 按上述配方用馏蒸水溶解至300 mL。用10 mol/L NaOH调pH至7.27.4。分装150三角烧瓶中每瓶30。然后置高压蒸汽消毒锅以1.1/cm2 灭菌20。 SE溶液0.15 mol/L NaCl 0.1 mol/L EDTA（pH 8.0）。20% SDS 溶菌酶5 mol/L过氯酸钠氯仿/异戊(24:1)醇SSC溶液mol/L 柠檬酸钠 3 mol/L NaCl 10 mg/mL RNA酶称取10 mg核糖核酸酶A于灭菌的Ep管内，加1 mL 100 mmol/L pH 5.0NaAc溶液，即为10 mg/mL RNA酶A，为了破坏脱氧核糖核酸酶，置80水浴中10 min或100水浴2 min，然后存-20C保存。 超净工作台；电热恒温培养箱；台式高速冷冻离心机；高速离心机；稳压电泳仪；紫外检测仪；水平式电泳槽；水浴锅；水平仪；摄影设备；高压蒸汽消毒锅20 (L、200 (L、1000 (L微量移液器。玻璃棒，500 mL三角烧瓶，100 mL、250 mL烧杯，50 mL、10 mL量筒，50 mL塑料离心管，1.5 mL Ep管，20～200 (L、1000 (L吸头。 五、实验方法 １．将200 mL LB液体培养基中生长的菌液4000 r/min离心10，收集菌体SE溶液洗涤菌体，重悬于20 m SE溶液中2.0 mL 20% SDS、10 mg溶菌酶，混匀，37保温，不时振荡，菌体溶解（约3060 min）后，置60水浴中105 mol/L 过氯酸钠至终浓度为1 mol/L，再加入1倍体积的氯仿/异戊醇，缓振20，12000 r/min离心52倍体积100%的乙醇，混匀，用玻棒轻轻缠出DNA细丝(L清洗。 6．将玻璃棒置离心管中，用0.1×SSC冲洗，使DNA溶解，然后用20×SSC溶液调整浓度为1×SSC7．加入2倍体积100% 冷乙醇，室温混匀-20℃放置30 min。 8．4℃ 12000 r/min离心5 min，小心除去上清，除尽壁液。 9．加70% 冷乙醇300 (L，清洗沉淀。4℃ 12000 r/min 离心5 min，去上清。 10．加28 (L TE，2 ( RNA酶11．制取0.% 的琼脂糖凝胶板（含0.5 (/mL溴化乙锭），插好点样梳12．凝胶冷却，加缓冲液使平板微没，抽出点样梳13．加1 (10 (L，接通电源，电压50 V/cm，约12 h，将点样胶在紫外灯下观察DNA谱带。2倍体积100% 的乙醇DNA谱带点样 cm左右。 3．可以在方法1后，菌体重悬于10 m SE溶液中 mL菌液，以后按1/10量操作。 六．作业与思考题 1．用玻棒轻轻缠出DNA细丝(L清洗？ 实验二 质粒DNA的分离提取 方法一 碱变性法提取质粒DNA 一、原理和用途 碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但是共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节其pH到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构象，保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成单链的网状结构。通过离心，染色体DNA与不定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。碱变性提取质粒的DNA可以用于酶切、连接、重组鉴定、PCR扩增和建基因文库等。 二、实验材料 大肠杆菌JM109(或DH5a)含有pUC18(或pGEM )、溶液LB液体培养基精解蛋白胨 3 酵母浸出粉 1.5 g 氯化钠 3.0 g 葡萄糖 0.6 g 按上述配方用馏蒸水溶解至300 mL。用10 mol/L NaOH调pH至7.27.4 。分装150三角烧瓶中,每瓶30。每组一瓶然后置高压蒸汽消毒锅, 1.1/cm2 灭菌20。2．抗菌素： (1) 氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制在灭菌有盖试管中，母液浓度为10