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（一）真核生物基因的表达调控的特点 1. DNA量大，不存在操纵子结构 （二）转录前表达调控 发生在基因组水平上的基因结构的改变。包括基因 丢失、基因扩增、基因重排、甲基化修饰及染色质 结构影响。 常用的酵母启动子： 与糖代谢相关的启动子： 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子（GAP）甘油激酶基因启动子（PGK） 酸性磷酸酶基因启动子（POH5） 与醇代谢相关的启动子， 醇氧化酶基因启动子（AOX，MOX） （1）提高外源基因在酵母中的表达水平 b.提高外源基因表达盒在宿主中的拷贝数 提高外源基因在宿主的拷贝数对基因的表达水 平有明显的影响，一般来说拷贝高的表达量也 高。 提高外源基因拷贝的方法 ？利用酵母天然的内源多拷贝质粒，如酿酒酵母的2um质粒，可以达到60～100个拷贝以上。但是这种内源质粒连上外源基因后在非选择性培养基会存在不稳定的想象，有时拷贝数会低于10个以下。 提高外源基因拷贝的方法 ？利用酵母基因组中的多拷贝重复序列进行整合获得多拷贝。不是所有的酵母都有天然的内源多拷贝质粒，但是所有的酵母都有多拷贝重复序列。如利用rDNA序列作为整合位点可以达到60～100个拷贝以上。在非选择性培养基也十分稳定。 作为基因表达的宿主需要具备的条件： 安全无致病性 有较清楚的遗传背景，容易进行分子操作 容易进行载体的导入 培养条件简单，容易进行高密度培养 有良好的蛋白质分泌能力 有类似高等真核的翻译后修饰功能 二、酵母表达载体的基本结构 由于大肠杆菌的的转化简单、高效，质粒的制备方便，因此酵母的表达载体为了操作上的简单，一般都是构建成带有大肠杆菌质粒基本骨架的酵母－大肠杆菌穿梭载体。 酵母表达载体的构件： DNA复制起始区 选择标记 整合介导区 有丝分裂稳定区 表达盒 （一）DNA复制起始区 这是一段具有功能的DNA复制起始的DNA序列。这种序列通常来自酵母的2u质粒的复制起始位点或酵母基因组中的自主复制序列（autonomously replication sequence，ARS）。 DNA复制起始区能使载体在细胞具有复制并分配到子代细胞的能力。 整合型载体中不需要DNA复制起始区，单在非整合型载体中是必不可少的。 （二）选择标记 选择标记是载体转化酵母时筛选转化子所必须的元件，它们能和宿主的基因型配合，或者能使宿主产生新的表型，从而筛选出重组子。 酵母表达系统具有两种筛选标记有两类： a.营养缺陷型筛选标记，如leu2、ura3、his3、lys2等。 b. 显性筛选标记，如G418、CYH、ARS等。 显性筛选标记的优点是它可以用于野生型酵母菌株的转化，可以用于多倍体酵母。 （三）整合介导区 这是以宿主基因组序列高度同源的一段DNA序列，它可以介导载体盒宿主染色体之间发生同源重组，使载体整合到染色体上。理论上染色体的任何序列都可以作为整合介导区。但是方便使用是营养缺陷型的选择标记。如果需要获得多拷贝的重组菌可以采用基因组的重复序列（如rDNA、Ty序列）。 （四）有丝分裂区 有丝分裂区的作用就是当细胞有丝分裂时能帮助载体在母细胞和子细胞之间平均分配，是决定转化子稳定性的重要因素。常用的有丝分裂区是来自酵母的着丝粒片断，此外来自酿酒酵母的2u质粒的STB片断也是有助于提高游离载体的稳定性的。 （五）表达盒 表达盒是酵母表达载体最重要的元件，它主要由启动子和转录终止子组成，如果是要构建分泌载体还需要有信号肽序列。 a.启动子 启动子是酵母表达载体的核心构件，一般为1～2 kb，不同的酵母会采用不同的启动子，也有组成型启动子等。 一般来说外源基因在酵母中的表达与启动子密切相关，所以筛选高效的启动子来表达外源基因就显得更为重要了。 常用的酵母启动子： 与糖代谢相关的启动子，GAP、PGK 与醇代谢相关的启动子，AOX 糖代谢相关的启动子，如ADHI、PGK、GAP、ENOI等，这些启动子在早期被看作是组成性的，能在酵母菌中高水乎组成性表达，可用于 克隆哺乳动物基因，但后来发现能被葡萄糖诱导，例如用PGK启动子表达a－干扰素时，在醋酸盐作碳源的培养基中加葡萄糖可诱导 20～30倍。这类启动子已广泛应用于实验室，也有用于工业的。第二类是强调节启动子，其中GAL1、GAL7和GAL10是半乳糖调节启动子，已用作真核生物转录调节的关建模式系统。 b. Kozak序列 Kozak序列是位于起始密码子前面的核糖体结合位点，作用相当于原核生物的RBS序列，在酿酒酵母中Kozak序列一般是AAAAAA(ATG) c. 转录终止子和加poly-A信号序列 终止子决定mRNA 3‘末端的形成效率，在酵母中和高等真核生物相似也需要进行前体mRNA的加工和加pol