免疫学技术原理与应用第5章-20161018.pdf

免疫学技术原理与应用 PAIT-05 免疫组织化学技术 孙 汭 中国科技大学生命科学学院 免疫学研究所 PAIT-05 免疫组织化学技术 一、免疫组织化学技术的概念 二、免疫组织化学的基本技术 三、免疫酶组织化学技术 四、免疫荧光组织化学技术 五、其它免疫组织化学技术 六、免疫组化常见问题的处理 七、免疫组织化学染色应用举例 一、免疫组织化学技术的概念 免疫组织化学(immunohistochemistry)又称免疫细胞化学(immunocytochemistry)，是利用 特异性抗原、抗体反应，对组织细胞的特定抗原（或抗体）进行定位和定量的技术。即带显 色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗 原进行定性、定位、定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙 地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜) 的显像和放大作用，在细胞、亚细 胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等) 。 历史：免疫组化技术近年来得到迅速发展。50 年代还仅限于免疫荧光技术，50 年代以 后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。 免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异 性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞 化学反应以及呈色反应；6.观察结果。 二、免疫组织化学的基本技术 1 基本技术流程 组织切片技术 ：固定、包埋、切片、染色、镜检 2 细胞组织的取材 组织标本的取材及保存 活检标本的取材：组织来自手术切除标本、钳取活检、穿刺活检， 或者来自尸体剖验。 手术切除标本的取材：病灶区、病灶与正常组织交界处（同时有抗原阳性和阴性，以形 成自身对照）。但是要避开坏死区 （强烈的非特异着色）。 1 实验动物的取材：低等动物（原生动物、腔肠动物），冷或热的固定剂；小动物 （青蛙， 小鼠），断头放血法 （痉挛）；大动物 （狗，猫，兔，天竺鼠），静脉空气法（各脏器淤血， 脑心人为性病变）, 扑杀法 （脑后猛击）, 麻醉窒息法（肺部充血，呼吸道病变）。 注意事项：1、锋利的刀刃，镊取时动作要轻，避免破坏细胞的形态，加重非特异染色。 2 、为充分保持组织的抗原性，取材要快，尽量保持组织新鲜。 组织标本的速冻：干冰-丙酮法、液氮法 细胞标本的取材 印片法：常用于活检或手术切除标本。 穿刺吸取涂片法：常用于淋巴结、软组织、肝、肾、肺等系针头穿刺 体液沉淀法涂片：胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。 培活细胞：用于实验室研究，如单抗筛选、细胞骨架蛋白的定位等。 注意事项：1、为防止脱片，应在载玻片上涂黏附剂;2 、为节省试剂及便于镜下观察和 计数，将细胞集中到直0.6-1.0cm 圆圈内，细胞总数以105 为宜。 3 组织细胞材料的固定 免疫组化的固定法 免疫组化固定方法的原则：最好地保存细胞和组织的形态结构最大限度地保存抗原的免 疫活性。 固定方法：物理固定法：如血涂片快速空气干燥法、冻结干燥法。 化学固定法：1、浸润法（immersion method ）将组织浸泡在固定液中，必要时可在低温 （4oC ）下进行，固定时间一般在3-12h；2、灌流法（irrigation method ）此法适用于动物实 验研究。麻醉动物，经动物左心室主动脉插管，生理盐水冲洗，注入固定液，组织在30min 内取材，继之浸入固定液中1-3h 。 重要的固定液 1、醛类固定剂：是双功能交联剂。使组织间相互交联，保存抗原于原位。特点是对组 织穿透性强，收缩性小。是常用的固定剂。 甲醛固定液（10%福尔马林）：有效的保护某些抗原的同时，能很好保持组织形态结构 的完整。但由于甲醛使蛋白质发生交联而起固定作用，会影响细胞膜的通透性，有时会使大