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免疫7-8, ELISA, 凝集实验 20150106 cyx
《微生物学与免疫学实验》
本学期的免疫学实验内容
八个实验,四周完成:
1. 抗血清的制备与分离(1)
2. 巨噬细胞的分离与形态观察(1)
3. 抗体的纯化——硫酸铵沉淀(2)
4. 双向琼脂扩散——检测特异性抗体(2)
5. 酶标抗体制备及其提纯(3)
6. 单向琼脂扩散——测抗体效价(3)
7. 酶联免疫吸附试验——ELISA(4)
8. 凝集试验——快速检测(4)
今天的实验内容与要求
• 实验7. 酶联免疫吸附试验(ELISA)
• 实验8. 间接凝集试验法检测血清类风湿因子(凝集试验)
要求:
• 掌握ELISA的技术原理与操作方法
• 了解检测血清类风湿因子的免疫学快速检测方法——
凝集试验
今天的上课流程:
① 进行实验7. ELISA 的“封闭”步骤的操作,等待30min
② 讲解约30min
③ 进行实验7. ELISA的一抗加样,孵育等待30min
④ 进行实验8. 凝集试验的操作
⑤ 进行实验7. ELISA的二抗加样,孵育等待30min
⑥ 进行实验7. ELISA的显色步骤,孵育15min,观察结果
实验7. 双抗体夹心ELISA法检测人血清中
的抗体含量
1. 抗体包被:将羊抗人IgG抗体预先包被于96孔酶标板上,包
被量是100 µl/孔,4℃包被过夜(已完成);
2. 封闭:每小组领取1个板框,内含1条12孔的板条,在水槽中
甩净孔中液体,加入约400µl PBST洗涤液,注意别溢出,静
置30秒,甩净,扣干。然后,用记号笔标记小组号和孔编号,
每孔加入200 µl的2%小牛血清,放入37 ℃温育30 min ;
1 2 3 4 5 8 9 10 11 12
A 同学 B同学
酶联免疫吸附实验
(enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA)
1. 将抗原或抗体吸附于固相载体表面,并保持其免疫
学活性;
2. 将抗原或抗体进行酶标记,并使酶标产物保持其免
疫学的特异结合活性和酶学的信号放大活性;
3. 利用抗原抗体的特异性免疫反应以及酶的催化活性
进行抗原抗体的定性或定量分析。
ELISA的一般实验步骤
间接ELISA为例
1. 包被
反应产物
↓
2. 封闭 (6)
↓ 加入底物
3. 加样(抗原抗体反应) (5)
↓
(4)
4. 加酶(酶标抗体结合) 酶标抗体
↓ 抗原抗体结合 结合
(3)
5. 显色(加底物) 包被 封闭
↓ (1) (2)
6. 读值(测定显色反应)
包被(Coating):
以物理吸附的方式使抗原
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