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几类PCR新技术的介绍
河南环球仪器设备有限公司
张胜利
河南环球仪器设备有限公司 1
几类PCR新技术的介绍
1.热启动PCR
2.Touch-down PCR
3.RT-PCR
4.兼并引物PCR (Degenerate Primer )
5.巢氏PCR (Nested PCR )
6.反向PCR (Inverse PCR )
7.不对称PCR (Asymmetric PCR )
8.原位PCR
9.重组PCR
10.多重PCR
河南环球仪器设备有限公司 2
几类PCR新技术的介绍
11.免疫-PCR(immuno-PCR)
12. 甲基化特异PCR(MSP)
13.标记PCR和彩色PCR
14.连接酶链反应(Ligase chain reaction,LCR)
15. cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of
cDNA ends, RACE )
16. AFLP (扩增性片段长度多态性)
17. 依赖核酸序列的扩增
18. 转录依赖的扩增系统
19.定量PCR
河南环球仪器设备有限公司 3
热启动PCR
1.概述:尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃,聚
合酶在室温仍然有活性。因此,在进行PCR反应配制
过程中,以及在热循环刚开始,保温温度低于退火温
度时会产生非特异性的产物。
热启动就是PCR仪达到变性温度再加入Taq DNA聚
合酶,从而抑制一种基本成分延迟DNA合成。
2.应用:如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的
遗传元件的构建和操作
3.使用条件:好的引物设计,
4.优缺点:⑴优点:提高PCR特异性最重要
⑵缺点:方法十分烦琐,尤其是高通量应用。
河南环球仪器设备有限公司 4
Touch-down PCR
1. 定义:又称降落PCR. 即选定一个温度范围,如50-35℃,
每降1-2 ℃进行1-2个循环,然后在50度下进行15个循
环。
2.原理:随着退火温度的降低,特异性逐步降低,但特异性
条带在温度较高时已经扩增出来,其浓度远远超过非
特异性条带,随着退火温度的降低,特异性条带优先
被扩增。
3.选择初始复性温度的原则:起始复性温度应该比引物的
Tm值高出5-10度,然后每个循环递减1-2度。
4.应用范围:
⑴low copy of targeted DNA; ⑵RT-PCR using oligo-dT;
⑶high degree degeneracy (or less specific) of the first set of
primers.
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RT-PCR
1.定义:是以RNA为模板,联合逆转录反应
(reverse transcription ,RT )与PCR ,可用于检
测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA
模板。RNA扩增包括两个步骤: 在单引物的
介导下和逆转录酶的催化下,合成RNA的互补
cDNA;加热后cDNA与RNA链解离,然后与另
一引物退火,并由DNA聚合酶催化引物延伸生
成双链靶DNA,最后扩增靶DNA。
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RT-PCR
2.检测方法
⑴一步法:利用同一缓冲
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