分子遗传学_DNA复制_2010_2.pdf

5. 参与DNA复制发动的蛋白质 • (1) 复制子特异性 • (2) 参与DNA复制发动的蛋白质种类 通过两种途径来了解： a. 发动突变型：DnaA, DnaB, DnaC, RNA多聚 酶，旋转酶(gyrase)，拓扑异构酶I(top) b. oriC体外复制 – 蛋白的取得: 突变型；组分重建 – 蛋白的种类：DnaA, DnaB, DnaC, 旋转酶, SSB, HV(类组蛋白)与oriC形成合成物；引物酶(dnaG), 合 成RNA引物；DNA多聚酶全酶, SSB。 两种研究方法得出的结果基本一致，但也有一些 不同。 • （3 ）蛋白作用的先后 a. 不同的条件致死突变型 dnaAts dnaCcs (cold sensitive) 能在320C 中生长。dnaCcs不能在200C;dnaAts不能 在410C生长  说明 dnaA 比dnaC早作用。 DNA 0 0 0 0 20 C 41 C 41 C 20 C dnaA dnaC dnaC dnaA • B. 抑制剂 0 0 dna 42 ℃ 50min Rif 42 C 10min 30 C ts 图1说明对利福平敏感的阶段（在加入Rif前能完 成），在dnaC作用阶段前；而在dnaA,dnaB作用 阶段后或同时作用 图2利用利迪链霉素作类似的实验，定出Stl敏感阶 段在dnaA, dnaC作用阶段前而在dnaB作用阶段的 以后或同时作用。这样就可定出基因作用顺序为 dnaB dnaA dnaC 。未排除dnaA, dnaB, dnaC独立作用。 +Rif dnaC +Stl dnaA,C dnaA,B dnaB 0 0 0 0 42 C 30 C t 42 C 30 C t 图1 图2 蛋白的协同作用 主要通过抑制基因研究 一般方法有：体外结合（分子量差异；物理 性质）；酵母双杂交 dnaAts 40 ℃ 生长10-7 真回复/抑制基因 das(dnaA suppressor) 共发现有7个das基 因，DasA， DasB， DasC， DasD(rpoB)， DasE， DasF， DasG rpoB编码RNA多聚酶β亚基。大多数rpoB突变 型具有利福平抗性表型。dnaAts 在40 ℃中长 出的菌落有一部分为Rifr,而dnaAts在30 ℃中长 出的Rifr菌落有一部分在40 ℃中能生长。从一 系列不同的途径得到了许多rpoB突变，分别引 入几个dnaA突变型，看40 ℃能否生长。发现 抑制作用有高度位点专一性。说明RNA多聚酶 可能是与DnaA蛋白形成复合物协同作用而发 动DNA复制。另外，发现rpoB抑制gyrBts突 变，提示DnaA, Rna pol和旋转酶在复制发动 中协同作用。 6. DNA复制的调控 • 现在已知DNA复制的调控作用在DNA发动阶 段。调控有可能是正控制的，即细胞长到一 定阶段体内积累了足够多的正控制蛋白，于 是DNA复制便得以发动。也可能是负控制 的，即细