大学基因工程.pdf

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大学基因工程

基因工程复习归纳 第一章 绪论 1.基因工程的定义:是指按照人们的愿望,经过严密的设计,将一种或多种生物体(供体)的基因 与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体/宿主)内,使之按照人们的意愿稳定 遗传、并表达出新的性状的技术。 2.基因工程概念的发展:遗传工程→DNA 重组技术→分子/基因克隆(Molecular/Gene→基因工程→ 基因操作。应用领域以“基因工程” 、“DNA 重组”为主 基因工程基因工程的历史性事件 1973:Boyer 和 Cohen 建立 DNA 重组技术 1978:Genetech 公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1982:世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市 1988:PCR 技术诞生 1989:我国第一个基因工程药物 rhIFN α1b 上市 2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒 p53 上市 3.基因工程的三大关键元件 基因(供体):外源基因、目的基因 载体:能将外源基因带入受体细胞,并能稳定遗传的 DNA 分子(克隆载体、表达载体)。 宿主(受体):,能摄取外源 DNA、并能使其稳定维持的细胞(组织、器官或个体)。 4.基因工程的基本步骤 (切、接、转、增、检(大肠杆菌是中心角色) (1)目的基因的获取:从复杂的生物基因组中,经过酶切消化或 PCR 扩增等步骤,分离出带有目 的基因的 DNA 片断。 (2 )重组体的制备:将目的基因的 DNA 片断插入到能自我复制并带有选择性标记(抗菌素抗性) 的载体分子上。 (3 )重组体的转化:将重组体(载体)转入适当的受体细胞中。 (4 )克隆鉴定:挑选转化成功的细胞克隆(含有目的基因)。 (5 )目的基因表达:使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。 第二章 DNA 重组克隆的单元操作 一、用于核酸操作的工具酶 1. 限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中,帮助细菌限制外来 DNA 的入侵) 。 限制性核酸内切酶的功能与类型 主要特征 I 型 II 型 III 型 功能 限切/修饰 限切 限切/修饰 蛋白结构 异源三聚体 单体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM 识别序列 TGAN8TGCT 旋转对称序列 GAGCC AACN6GTGC CAGCAG 切割位点 距识别序列 1kb 处 识别序列内 距识别序列下游 24-26bp 处 其中 II 型限制性核酸内切酶:切割位点专一,适于 DNA 重组,是 DNA 重组中最常用工具酶。 特点:1.识别、并切割双链 DNA 分子中特异序列的 DNA 内切酶。2.识别序列为 4 6 碱基对的回文对 称结构 (旋转对称结构)。3.单体蛋白、仅有限制性内切酶活性,无甲基化酶活性。4.切割产物末端: 5’突出末端、3’突出末端、平头末端.6.最适温度:大多为 37℃,适盐浓度:高盐、中盐、低盐。8.当 反应条件不适合时,识别和切割序列发生变化 (星号反应)。 星活性(star activity ):在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的 特殊性称星活性。 引起星活性的因素: ① 高浓度甘油(5% )、② 酶过量(100U/g )、③ 低离子强度(25mM ) ④ 高 pH (pH8.0)、

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