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基因工程复习归纳 第一章 绪论 1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因 与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定 遗传、并表达出新的性状的技术。 2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA 重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→ 基因操作。应用领域以“基因工程” 、“DNA 重组”为主 基因工程基因工程的历史性事件 1973：Boyer 和 Cohen 建立 DNA 重组技术 1978：Genetech 公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市 1988：PCR 技术诞生 1989：我国第一个基因工程药物 rhIFN α1b 上市 2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒 p53 上市 3.基因工程的三大关键元件 基因（供体）：外源基因、目的基因 载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的 DNA 分子（克隆载体、表达载体）。 宿主（受体）：，能摄取外源 DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。 4.基因工程的基本步骤 （切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色） （1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或 PCR 扩增等步骤，分离出带有目 的基因的 DNA 片断。 （2 ）重组体的制备：将目的基因的 DNA 片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性） 的载体分子上。 （3 ）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。 （4 ）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。 （5 ）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。 第二章 DNA 重组克隆的单元操作 一、用于核酸操作的工具酶 1. 限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来 DNA 的入侵) 。 限制性核酸内切酶的功能与类型 主要特征 I 型 II 型 III 型 功能 限切/修饰 限切 限切/修饰 蛋白结构 异源三聚体 单体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM 识别序列 TGAN8TGCT 旋转对称序列 GAGCC AACN6GTGC CAGCAG 切割位点 距识别序列 1kb 处 识别序列内 距识别序列下游 24-26bp 处 其中 II 型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于 DNA 重组，是 DNA 重组中最常用工具酶。 特点：1.识别、并切割双链 DNA 分子中特异序列的 DNA 内切酶。2.识别序列为 4 6 碱基对的回文对 称结构 （旋转对称结构）。3.单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性。4.切割产物末端： 5’突出末端、3’突出末端、平头末端.6.最适温度：大多为 37℃,适盐浓度：高盐、中盐、低盐。8.当 反应条件不适合时，识别和切割序列发生变化 （星号反应）。 星活性（star activity ）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的 特殊性称星活性。 引起星活性的因素： ① 高浓度甘油（5% ）、② 酶过量（100U/g ）、③ 低离子强度（25mM ） ④ 高 pH (pH8.0)、