实验六 质粒抽提和酶切2015.pdf

实验四 质粒DNA的提取、 酶切与鉴定 李卫芳 王秀海 陈黎 实验内容 1. 大肠杆菌质粒DNA 的分离及纯化 （碱变性法） 2.2. 质粒DNADNA 的双酶切实验 载体的设计和应用是DNA体外重组的重要步骤。 作为基因工程的载体必须具备下列条件: ①是一个复制子，载体有复制起点才能使与它结合的外源基因在受 体细胞中复制繁殖; ②载体在受体细胞中能大量增殖，有高复制率才能使外源基因在受 体细胞中大量扩增体细胞中大量扩增;; ③载体DNA链上有一到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点， 便于外源基因的插入; ④载体具有选择性的遗传标记，如有抗氨苄青霉素(AmpR)，抗卡那 霉素基因(KanR)等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这 个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。 质粒： 质粒(plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1- 2OO kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于 细菌、放线菌和真菌细胞中。 质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒 定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞 质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能 存活，而它控制的许多生物学功能也可对宿主细胞的相应缺陷 进行补偿。 • GI基因到 pTKD 质粒中的 pTKD GI质粒, 长度大约为 3 + 1.3 (kbp). 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤 1.培养细菌使质粒扩增; 2.2.收集和裂解细菌收集和裂解细菌;; 3.分离和纯化质粒DNA。 大肠杆菌质粒DNA 的分离及纯化 （碱变性法原理） 溶菌酶：可破坏菌体细胞壁； 十二烷基硫酸钠(SDS) ：可促使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离 子去污剂子去污剂(SDS)(SDS)处理后处理后，，变性的细菌染色体变性的细菌染色体DNADNA缠绕附着在细胞缠绕附着在细胞 壁碎片上，当以pH 4.8 的NaAc高盐溶液去调节其pH至中性时, 变性的质粒DNA又恢复原来的构型, 保存在溶液中，而染色体 DNA不能复性，随着细胞碎片等一起被沉淀。最后经乙醇沉淀、 洗涤，可得到纯的质粒DNA 。 质粒的构型与电泳迁移率 6 7 质粒DNA 的相对分子质量一般在l0 ~ 10 范围内，如质粒 6 pBR322 的相对分子质量为2.8 ×10 ，质粒pUCl9 的相对分子质量 6 为1.7 ×1O 。 共价闭环DNA (Covalently Closed Circular DNA，简称cccDNA)常 以超螺旋形式存在。 开环DNA (open circular DNA，简称ocDNA) ：如果两条链中有 条链发生一处或多处断裂，分子就能解旋而消除链的张力，这种 松弛型的分子叫作ocDNA 。 线型DNA (linear DNA): 若两条链同时发生断裂，呈线性构型。 在电泳时，同一质粒如以cccDNA形 式存在，它比其开环和线状DNA 的 泳动速度快，而ocDNA 电泳阻力最 大，泳动速度最慢。因此在本实验 中中，，自制质粒自制质粒DNADNA在电泳凝胶中呈在电泳凝胶中呈 现2 ~ 3条电泳区带。要减少DNA链 的断裂，提取DNA 的操作应避免强 力吹打和震荡，要尽量轻柔。 离心机的正确使用： 平衡： 在转子的对称位置的管子等重量，小的台式 离心机则仅要求对称位置2管要有大约等体 积的溶液积的溶液 清洁：离心管盖子要盖紧，防止漏液。若有 漏液，要及时清洁，以防转子腐蚀报废。 操作流程： 本次质粒提取方法请按以下方法进行 （一种不用酚与氯仿的 质粒提取法，减少环境污染，也更安全）。 注意注意：：每人收取每人收取33 mlml的菌液的菌液，，也即先取也即先取11..55 mlml，，离心去除上离心去除上 清后再取1.5 ml离心，以提高质粒的收获量。 图 质粒DNA酶