小鼠胚胎干细胞.pdf

第四课 小鼠胚胎干细胞 的培养和分化 内容提要 1. 小鼠ES细胞建系过程和关键所在 2. 影响小鼠ES细胞建系效率的因素 3. 小鼠ES细胞的特征描述 1.1 胚泡来源 延迟着床方法获得的延迟胚泡  自然状态下合笼获得的正常胚泡 超排卵法得到超排卵胚泡 通过核移植的途径获得重构胚, 进而获得胚 泡。 延迟植入囊胚步骤  雌、雄合笼过夜，次晨检查雌鼠阴道栓，有 栓雌鼠分开饲养（记为0天）。  第二天通过腹腔注射10μg它莫西芬和1mg Depo-Provera ，来降低雌激素水平而保持孕 激素水平。  在第6-8天处死动物，冲洗宫腔获得延迟植入 囊胚，其个体较大，外观略粗糙，常有清晰 可见的ICM 。  使用延迟植入囊胚并不影响胚胎的贴壁, 主 要是在ICM 的增殖方面明显地优于正常的胚 泡, 因此也对后来的ES 细胞集落的出现和生 长带来有利的影响。  但是得到的胚胎的数目少、处理过程较为繁 杂。  获取胚胎前，按照能够快速取用的原则准备 好所有必要试剂、培养基和器械，减少胚胎 在体外环境的时间。 超排卵是通过给母鼠注射性激素, 人为制造 性周期后与公鼠合笼, 进而获得胚泡。可以 用较少的实验动物得到较多的胚泡。 取自自然交配雌鼠的胚胎质量较高；取自超 排卵雌鼠的胚胎数目较大。 这两种条件下，通常从3.5dpc动物子宫收集 胚胎，此时胚胎正好处于囊胚期，不需要进 一步培养即可用于建立ES细胞。 细胞核移植获得胚泡  利用显微操作方法把供体细胞核移植入去核 的受体卵母细胞中，然后经过活化后获得重 构胚胎的过程。  重构胚胎在体外发育到囊胚阶段后，一方面 可以移入受体动物体内以获得克隆动物，另 一方面，可以用于建立核移植胚胎干细胞系 (ntES)。而ntES 细胞可以在体外被诱导形成 特定的体细胞用于治疗。 DEVELOPMENTAL DYNAMICS 235:2460 –2469, 2006 1.2 饲养层准备  饲养层能够抑制ES 细胞的分化, 一般认为是 由于饲养层可以分泌白血病抑制因子( LIF) 以及成纤维细胞生长因子(FGF), 前者是释放 到培养基中, 后者结合在饲养层的细胞膜上。  有两种细胞可以充当饲养层细胞：STO细胞 和小鼠原代成纤维MEF细胞。  要求：新鲜配制、理想密度、代数较低。 STO成纤维细胞  STO细胞是来自SIM小鼠的成纤维细胞，广 泛用于多潜能畸胎瘤细胞及胚胎干细胞的培 养。  STO作为连续细胞系具有明显优点：连续传 代，易生长；但应特别注意保持STO细胞生 长的最佳条件，密度不能太高，传代20-30 次后，应重新复苏。 STO饲养层的制备  STO细胞在10cm培养皿中铺满后，用 DMEM/10%NCS+10μg/ml丝裂霉素C孵育 2-3小时。  PBS洗涤——胰酶消化——洗涤——培养 基重悬——接种明胶包被的培养皿备用 （不超过一周）。 STO feeder cell MEF饲养层的制备 MEF取自交配日后12.5d的ICR孕鼠，3-6代 的细胞用作饲养层。复苏的MEF细胞只能传 代一次（即第二代细胞用于饲养层）。 ϒ-射线照射或丝裂霉素处理后，以5 ×104 /cm2 接种到明胶包被的培养皿，以保证得到 铺满的细胞单层。 制备好的MEF应该在3d内使用 Mitotically inactivated MEFs on an Attachment Factor-coated culture plate in MEF medium 无饲养层培养体系  无饲养层条件下，通常需要用一些基质处 理培养皿，如0.1%明胶、IV 胶原、多聚赖 氨酸、纤粘蛋白和层粘蛋白等。  在培养液中添加LIF 可以支持小鼠ESC