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相对定量：ΔΔCT法和相对标准曲线法 定量PCR: 相对基因表达量 2 示例实验 未处理 样本 处理后 样本 目的基因: Plat1 问题:样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化? 3 示例实验 未处理 样本 处理后 样本 目的基因: Plat1 问题:样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化? 4 实验流程 对照样本 time t=0 t=12 t=24 t=48 total RNA total RNA total RNA total RNA cDNA cDNA cDNA cDNA 5 目的基因与目的基因的比较 ∆Rn ∆Ct = 24 – 23 = 1 Ct = 24 Cycles Ct =23 未处理组目的基因 2-∆Ct =1/2 处理组目的基因 6 如果加入内参基因会怎样呢? ∆Rn ∆Ct = 24 – 14 = 10 ∆Ct = 23 – 13 = 10 Ct =14 Ct = 24 Cycles Ct = 13 Ct = 23 未处理组目的基因和内参基因 2- ∆ ∆ Ct =1 处理组目的基因和内参基因 7 两种相对定量的方法 比较Ct 相对标准曲线法 (ΔΔCt) 法 样本间的倍数关系 8 两种方法的区别? 比较Ct (ΔΔCt) 法 相对标准曲线法 • 已知各个基因的扩增效率 • 每个基因都要做一条标准曲线 • 不需要每次都做标准曲线 • 准确的扩增效率计算 • 简单, 经济, 通量较高 • 工作量大, 成本高, 通量较低 9 如何选择相对定量的方法？ A-F = ΔCt1 A F B 对应点相减 G C Ct